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第二章 酶与细胞的固定化
;引 言;高效率
高度专一性
可调控性
反应条件温和
广泛应用于酿造、食品、医药等领域 ;酶对环境十分敏感
物理因素:温度、压力、电磁场
化学因素:氧化、还原、有机溶剂、金属
离子、离子强度、pH
生物因素:酶修饰和酶降解
反应速度逐渐下降
反应后不能回收
对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂
怎样才能获得理想的生物催化剂? ;答案:
固定化酶
固定化细胞
;第二章酶与细胞的固定化;第一节 酶的固定化
?
; 固定化酶是??将水溶性的酶用物理或化学方法处理,使之成为不溶于水的,但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。
;固定化酶的优点
①极易将固定化酶与底物、产物分开;
②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应;
③在大多数情况下,能够提高酶的稳定性;
④酶反应过程能够加以严格控制;
⑤产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;
⑥较游离酶更适合于多酶反应;
⑦可以增加产物的收率,提高产物的质量;
⑧酶的使用效率提高,成本降低。;固定化酶存在的缺点
①?固定化时,酶活力有损失;
②增加了生产的成本,工厂初始投资大;
③只能用于可溶性底物,而且较适用于
小分子底物,对大分子底物不适宜;
④与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特
别是需要辅助因子的反应;
⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。;二、固定化酶的制备原则
根据应用目的、应用环境,选择固定化的方法 ,都要遵循以下基本原则 :
①必须注意维持酶的催化活性及专一性。
②固定化应该有利于生产自动化、连续化。
③ 固定化酶应有最小的空间位阻
④酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。
⑤固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
⑥固定化酶成本要低,以利于工业使用。 ;三、固定化方法
酶的固定化方法很多,但对任何酶都适用的方法是没有的, 必须经过实验研究才能确定。
;(一)非共价结合法
1.?结晶法
使酶结晶从而实现固定化的方法。
2.??分散法
通过酶分散于水不溶相中从而实现固
定化的方法。 ;3. 吸附法
(1)物理吸附法 利用氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上。
无机吸附剂:高岭土、皂土、硅酸、氧
化铝等
吸附量小、有些酶发生吸附变性
有机吸附剂: 大孔树脂、葡聚糖凝胶、纤维素衍生物、胶原等
吸附量略大(~50mg/g载体),不产生变性失活。
比较受重视。;(2) 离子结合法
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。
CM -纤维素、DEAE-纤维素
吸附量 50--150mg/g
优点:
操作方便,条件温和,可再生后反复使用
缺点:
结合力较弱,不适宜的pH,高盐浓度,高底物浓度,高温等往往能把吸附的酶解析下来。;吸附法;可以改善方法:
1.选择最佳条件操作(如温度、pH)
2.选吸附量大的载体,控制酶和载体量,
3.采用高酶量吸附
4.开发新载体
5.对酶进行修饰后再进行交换吸附;(二)化学结合法 ;共价结合法;
偶联成功与否取决于:
载体:功能基团,如羟基、芳香氨基,
羧基,羧甲基等
酶分子:侧链非必需基团
(游离的α--氨基,lys—ζ—NH2, Arg--胍基 C-COOH, Asp—γ--羧基,Glu---羧基, 酚羧基,巯基,咪唑基)
但是,载体、酶分子上的基团不会直接反应,其功能基团要活化。;1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点:
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物,再在温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。
; 如胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶的固定化,偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时,得到固化酶具很高酶活性
;2) 溴化氰-亚氨碳酸基反应
带羟基的载体在碱性条件下,载体的羟基和溴化氰反应,生成活泼的亚氨碳酸酯衍生物,在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。 最后一种是主要产物。
;此方法固定化后
相对酶活力比较高,
且相当稳定,
同时操作也简便。
是最受欢迎的一种方法;2. 交联法
利用双功能或者多功能试剂在酶分子之间或者载体之间;酶分子与载体之间进行交联反应而固定化。;双功能试剂:
常用的是戊二醛
O
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