生化大实验AKP碱磷酶的表达与纯化实验.pptVIP

;一、AKP简介; 大肠杆菌碱性磷酸酶(也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶， E.coli alkaline phosphatase，简称AKP/ALP，EC.3.1.3.1) ，在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。 ;碱性磷酸酶的不同分子状态 ;碱性磷酸酶的理化性质;二、蛋白纯化常用技术;1. 破碎 机械法、溶胀和自溶、化学处理、生物酶降解 2. 分 离 纯 化 沉淀：盐析、有机溶剂、聚乙二醇、加热 层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析、 金属螯合层析、吸附层析、分配层析等 离心、超滤等 3. 浓 缩 的 方 法 沉淀法、吸附法、超滤法、透析法、减压蒸馏法、 冷冻干燥法 4. 测 定 方 法 光谱法： 吸收光谱法（直接测定法、比色法）、荧光法、浊度法、荧光光谱技术、红外光谱技术等 电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器法;5. 鉴 定 方 法 电泳：琼脂糖电泳、聚丙烯凝胶电泳 免疫分析：凝集反应、免疫扩散、固相免疫吸附、 免疫印迹等 色谱：气相色谱、高压液相色谱、质谱 特定的化学反应、PCR、生物芯片、DNA测序、 DNA重组杂交技术、表型变化等 6. 标记技术 7. 实验数据的测量、记录、处理与分析 8. 试剂的配制与保存 9. 样品的保存与处理;三、AKP表达纯化;实验设计;纯化方案的评估;培养、表达与菌体收集;细胞破碎;上样：将离心上清以0.5mL/min的流速连续地加入已平 衡好的DEAE-FF层析柱中, 每管接收3 mL； 洗涤：用40 mL Buffer B洗涤杂蛋白 流速：1mL/min，每管接收3 mL； 洗脱：用200 mL Buffer B其中含0－0.3mol/L 的连续 NaCl梯度洗脱AKP 流速：1mL/min，每管接收3 mL收集：收集有活性的AKP， 取200 uL加入200 uL 甘油 （Ⅱ号样品）， －20℃保存备用;热变性：80℃，水浴30min 4 ℃， 12000rpm×20min 留上清 硫铵沉淀：每100mL AKP溶液 + 加入60克固体硫酸铵 溶解后静置10分钟，10000rpm×10min 充分弃上清，沉淀-20 ℃保存，备用。 ;沉淀溶解：沉淀用0.5mL左右Buffer A充分溶解， 10000rpm×10min，留上清 分子筛层析： 将上述离心上清上样、洗脱（Buffer A） 洗脱流速为15 mL/小时，每管接收2 mL 透析浓缩：合并光吸收及酶活高峰管 Buffer C透析浓缩4小时 分装-20℃保存备用(Ⅴ号样品);pNP （对硝基酚）;1. LB培养基(预培养用培养基) 30mL/班 胰蛋白胨 0.3 g 酵母提取物 0.15 g 氯化钠 0.3 g 5mol/L NaOH调pH至7－8（经验值：200ul／L） 蒸馏水定容至30mL 2. TM培养基(表达培养基) 300mL/组 胰蛋白胨 3.6 g 酵母提取物 7.2 g 氯化钠 3.0 g 甘油 1.8mL 用1mol/L Tris调pH至7－8（经验值： 9.3mL／L） 蒸馏水定容至300mL