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4、双功能抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。 5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪90年代发展的研究领域。类型如下： （1）配基—配基型融合蛋白，如 CD4-Fcγ. （2）配基—Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受体—FV型融合蛋白 （5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶） 生物技术制药讲解之抗体制药 第三节 抗体工程 抗体研究的三个阶段： ①以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体； ②以1975年K?hler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表； ③以1994年Winter完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库技术,克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。 生物技术制药讲解之抗体制药 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1、获取目的基因 2、抗体库技术的载体： 3、淘筛（panning）： 4、表达与鉴定：。 生物技术制药讲解之抗体制药 1．获取目的基因 提取RNA经反转录PCR(RT—PCR)获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区(VH、VL)基因。抗体基因的组合形式多为单链抗体SCFV，也用连接链(G4S)3组合成功能分子。 生物技术制药讲解之抗体制药 2．抗体库技术的载体 现在普遍使用噬菌粒载体，它具有噬菌体和质粒的共同特点。因为它的转化效率高有利于提高文库容量。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。琥珀终止码在适当位置上引人载体是抗体库的关键性技术。而克隆位点后的基因序列则有利于对可溶性表达产物的鉴定和纯化。 生物技术制药讲解之抗体制药 3．淘筛 基本过程是，抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附……，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地扩增。 4．表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达。产物用Western-blot分析确定后，就完成了全过程。 生物技术制药讲解之抗体制药 Western Blotting免疫印迹 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 生物技术制药讲解之抗体制药 生物技术制药讲解之抗体制药 典型的印迹实验包括三个步骤： ①蛋白质的电泳分离 ②电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上。 ③免疫学检测。 生物技术制药讲解之抗体制药 二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。 3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。 生物技术制药讲解之抗体制药 三、基因工程抗体的表达 在筛选出阳性克隆后，按其目的不同，可选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同表达方式进行表达。 1．原核细胞表达 抗体表达，又分融合表达和分泌型表达两种。融合表达有利于对抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性