蛋白质分离纯化步骤.docxVIP

一、蛋白质分离纯化得一般原则????大多数蛋白质在组织细胞中都就是与核酸等生物分子结合在一起,而且每种类型得细胞都含有成千上万种不同得蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处,所以蛋白质得分离提纯就是一项复杂得工作。到目前为止,还没有一套现成得方法能把任何一种蛋白质从复杂得混合物中提取出来。但就是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适得分离纯化程序以获得高纯度得制品。且分离得关键步骤、基本手段还就是共同得。??????蛋白质提纯得目得就是增加产品得纯度与产量,同时又要保持与提高产品得生物活性、因此,要分离纯化某一种蛋白质,首先应选择一种含目得蛋白质较丰富得材料、其次,应设法避免蛋白质变性,以制备有活性得蛋白质、对于大多数蛋白质来说,纯化操作都就是在0～４℃得低温下进行得、同时也应避免过酸、过碱得条件以及剧烈得搅拌与振荡。另外,还要设法除去变性得蛋白质与其它杂蛋白,从而达到增加纯度与提高产量得目得。???????????????????????? 二、分离纯化蛋白质得一般程序??分离纯化蛋白质得一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料得预处理及细胞破碎?????分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来得天然状态,不丧失活性。所以要采用适当得方法将组织与细胞破碎。常用得破碎组织细胞得方法有:?????1。 机械破碎法??????这种方法就是利用机械力得剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。????2。 渗透破碎法???????这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。????3、 反复冻融法??????生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感得蛋白质不宜采用此法、???? ４. 超声波法???????使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。????５、　酶法?????? 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质得抽提?????通常选择适当得缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液得ｐH、离子强度、组成成分等条件得选择应根据欲制备得蛋白质得性质而定。如膜蛋白得抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritｏnX—10０等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质得变性、?(三)蛋白质粗制品得获得??????选用适当得方法将所要得蛋白质与其它杂蛋白分离开来、比较方便得有效方法就是根据蛋白质溶解度得差异进行得分离。常用得有下列几种方法:?????1、 等电点沉淀法??????不同蛋白质得等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。?????２。　盐析法?????不同蛋白质盐析所需要得盐饱与度不同,所以可通过调节盐浓度将目得蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来得蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性、??????3。 有机溶剂沉淀法?????中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们得介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中得溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质、此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面得水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适得有机溶剂浓度、?(四)样品得进一步分离纯化??????用等电点沉淀法、盐析法所得到得蛋白质一般含有其她蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度得样品。常用得纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲与层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度得蛋白质样品。??????1.　凝胶过滤层析??????凝胶过滤层析(gｅl-fｉｌtration chromaｔogrａphy)又称为分子排阻层析或分子筛层析。它就是将葡聚糖凝胶(Ｓeｐhadｅx)装入一个柱子中,制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具有网状结构,不同类型凝胶得网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时,比凝胶网孔小得蛋白质可进入网孔内,而大于网孔得分子则不能进入被排阻在凝胶颗粒之外。当用洗脱液洗脱时,被排阻得分子量大得蛋白质直接通过凝胶之间得缝隙先被洗脱下来,而比网孔小得蛋白质可连续不断地进入网孔内、这样得小分子不但流经得路程长,而且受到来自凝胶内部得阻力也很大,所以蛋白质越小,从柱子上洗脱下来所需时间越长。由于不同蛋白质得分子大小不同,进入网孔得程度不同,因此流出得速度不同,洗脱所用体积及时间不同,从而达到分离得目得、?????2. 纤维素柱层析法????该法就是利用蛋白质得酸碱性质作为分离得基础。离子交换纤维素(celluｌoｓe iｏn-ｅxchanger)就是人工合成得纤维素衍生物,它具有松散得亲水性网状结构,有较大得表面积,使