寡养单胞菌CW117中降解黄曲霉毒素B1的氧化酶筛选及活性验证.docVIP

PAGE 2 寡养单胞菌CW117中降解黄曲霉毒素B1的氧化酶筛选及活性验证 致 谢 本论文是在周育教授的指导下完成。在本次选题和研究过程中，得到周育教授的悉心教导，为我指点迷津，引导我走向正确的方向，帮助我开拓研究思路，精心点拨，热忱鼓励，周教授对于学术的认真严谨，深深的影响了我，对于细节的把控，更是让我精益求精，周育教授用自身的学识和人格魅力，让我不断向之努力进步，不仅授我以文，更加教会我为人处世，对于周教授的感激之情，实在言语无法表达，深刻于心，将终生受益无穷。 特别感谢杜郑君师姐，在她的细心教导下带领我走上科学研究的道路，帮助我排除了很多实验壁垒，传授我实验经验。同时感谢陈楠师姐、韩三青师姐、叶子菱师姐、蔡梦宇师姐、王志师兄和吉娜师姐等人的指导，帮助我克服了实验瓶颈，教会了我许多实验技巧。感谢我的同门曾秀丽、钱莺莺及刘长宇同学对我的学习生活中的照顾以及在我遇到实验问题时的对我给予的帮助与陪伴。感谢闫航滨师弟、骆晗师妹、叶婷师妹、费晴如师妹、汤梦婷师妹对我生活上的关心。同时感谢我的舍友徐军、丁燕燕和付贝贝对我的关心与包容，为我安心做科研提供了后勤保障。 最后感谢安徽农业大学为我提供了良好的科研平台及学习环境，在硕士学位攻读期间可以认识许多优秀的老师、结交许多优秀的同学，让我在这三年能快速成长，顺利完成毕业论文。 摘 要 黄曲霉毒素B1主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种次级代谢产物，广泛存在于霉变的粮食、坚果和饲料当中，具有严重的肝毒性、致癌、致畸和致突变性，与食品安全和人类健康问题等密切相关。因此，寻找有效的黄曲霉毒素B1降解脱毒方法对食品公共卫生安全具有重大意义。生物脱毒法因具有高效性、特异性且不易造成食物营养物质的流失及风味的改变而被人们广泛关注。目前，国内外研究主要集中在微生物解毒菌株的筛选及降解物质的分布这两个方面，而在生物酶的研究及筛选等方面有很大空缺。寡氧单胞菌CW117已被证明是可以降解赭曲酶毒素A和黄曲霉毒素B1两种毒素的双功能菌株。 本研究是在试验室前期已有基础上对该菌株降解黄曲霉毒素功能的研究，首先采用由自杀质粒pK18mobsacB介导的同源重组方法对其中的可降解黄曲霉毒素B1的漆酶进行敲除，再结合国内外对寡氧单胞菌CW117基因组信息及文献报道的降解酶，筛选出7个可能有降解黄曲霉毒素B1功能的氧化酶（过氧化物酶、双加氧酶、酸式还原酮双加氧酶、色氨酸2,3双加氧酶、4羟基苯丙酮酸双加氧酶、LLM类黄素依赖性氧化还原酶、铜抗性体系多铜氧化酶），通过pGEX-4T-1和pET-32a载体过对氧化酶进行体外异源原核表达， 并采用自杀质粒pK18mobsacB介导的同源重组方法对其中3个基因（4羟基苯丙酮酸双加氧酶、LLM类黄素依赖性氧化还原酶和铜抗性体系多铜氧化酶）进行基因敲除。通过对氧化酶进行异源表达和敲除，来验证菌株寡氧单胞菌CW117中氧化酶对黄曲霉毒素B1的降解功能。结果发现在将实验室研究中报道的可降解黄曲霉毒素B1的漆酶敲除后，菌株CW117△-1的降解效率与原始菌株之间无统计学差异（P＞0.05），这就说明在菌株CW117中还存在其他降解黄曲霉毒素B1的酶；从CW117筛选出的7个氧化酶中仅有4羟基苯丙酮酸双加氧酶对AFB1具有降解功能，4羟基苯丙酮酸双加氧酶的粗酶液在与黄曲霉毒素B1共孵育72 h后对黄曲霉毒素B1的降解效率约为14%，4羟基苯丙酮酸双加氧酶异源表达菌株培养后上清对黄曲霉毒素B1的降解效率可达到89%；进一步在漆酶缺失条件下构建4羟基苯丙酮酸双加氧酶双敲除菌株CW117△-2，结果发现菌体对黄曲霉毒素B1的降解并无统计学差异，但在不同培养时间后取上清分别与黄曲霉毒素B1等比例混合共同孵育的实验中，发现其在培养12 h和16 h，二者的降解效率存在统计学差异，培养12 h时二者的统计学差异为P0.01，培养16 h时二者的统计学差异为P0.05，其他培养时间点对黄曲霉毒素B1的降解率均具有不同的统计学差异。在CW117△-2基础上缺失LLM类黄素依赖性氧化还原酶的菌株CW117△-3，并没有观察到这两株突变株之间有降解率有统计学差异，以及在CW117△-3基础上对铜抗性体系多铜氧化酶的缺失菌株CW117△-4与CW117△-3二者之间无降解差异。上述结果表明，寡氧单胞菌CW117对黄曲霉毒素B1的降解机制较为复杂，可能存在多条降解途径。 关键词：黄曲霉毒素B1；生物降解；氧化酶；基因表达；基因突变 ABSTRACT Aflatoxin B1 is a kind of secondary metabolite produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, which widely exists