融合细胞hat筛选原理教学内容.pdfVIP

单克隆抗体制备过程中， 总共有两次筛选， 第一次筛选出杂交瘤细胞， 第二次筛 选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法： 细胞融合后， 杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选 的关键。普遍采用的 HAT 选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄 嘌呤（ H）、氨基喋呤（ A ）和胸腺嘧啶核苷酸（ T ）。其依据是细胞中的 DNA 合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（ “D途径 ”），即由氨基酸及其他小 分子化合物合成核苷酸，为 DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸 作为重要的辅酶参与这一过程， 而 HAT 培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物， 可以阻断 DNA 合成的 “D途径 ”。另一条途径是应急途径或补救途径 （“S途径 ”）， 它是利用次黄嘌呤 —鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 （HGPRT ）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK ） 催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在 HAT 培养液中，未融合的效应 B 细胞和两个效应 B 细胞融合的 “D途径 ”被氨基 喋呤阻断，虽 “S途径 ”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般 10d 左 右会死亡。 对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言， 由于通常采用的骨髓瘤细胞 是次黄嘌呤 —鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（ HGPRT ）细胞，因此自身没有 “S 途径 ”，且 “D途径 ”又被氨基喋呤阻断，所以在 HAT 培养液中也不能增殖而很快 死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互融合形成的杂交瘤细胞， 既具有效应 B 细胞的 “S途径 ”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT 培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的 方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应 B淋巴细胞， 因此，从 小鼠脾脏中取出的效应 B 淋巴细胞的特异性是不同的， 经 HAT培养液筛选的杂交 瘤细胞特异性也存在差异， 所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预 定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。 通常采用有限稀释克隆细胞的方法， 将杂交 瘤细胞多倍稀释， 接种在多孔的细胞培养板上， 使每一孔含一个或几个杂交瘤细 胞（理论上 30%的孔中细胞数为 0 时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这 些单细胞克隆生长， 最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 因 此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。