三重复合诱变和原生质体融合技术筛选林可霉素高产稳定菌株可行性研究报告.docVIP

南昌市科技计划项目可行性研究报 计划类别： 科技攻关 项目名称： 项目类别：生物技术及新医药工业化研究与开发专题 课题名称：三重复合诱变和原生质体融合技术 筛选林可霉素高产菌株 申请单位： 江西师范大学 （盖章） 项目（课题）负责人：王筱兰 起止年限： 2007.1—2009.1 通讯地址、邮编：江西师范大学生命科学学院33002 2 联系电话、传真：3926 002 报告编制单位：江西师范大学 二OO六年九月 编写说明 一、 本可行性研究报告格式适用于南昌市科技计划 （软科学研究计划、国际科技合作与交流计划除外）项目 开展可行性研究时使用，其主要依据是相应的南昌市科技 计划项目申请书。 二、 本可行性研究报告是南昌市科技局组织技术经济 可行性论证的主要材料和科技计划项目立项的重要依据, 各项内容应实事求是,逐项编写。 各项内容应实事求是, 逐项编写。 三、本可行性研究报告附件材料中，涉及引进技术的 项目，须附有技术引进协议和有关知识产权的文件。 四、本可行性研究报告一式六份，一律用A4纸打印, 于左侧装订成册。 南吕科技计划项0可行性研究报告 —、总论 项目的主要内容及技术原理简述 主要内容： 本研究基于以林可霉素产生菌林可链霉菌(Stre ptomyces L inloinensi s)为出 发菌株，采用加热、紫外线(UV)、DES三重复合诱变处理，用终点产物林可霉 素为选择压力进行梯度筛选，经摇瓶初筛、复筛获得较高效价菌株，最后用正 交设计来优化发酵培养基。本研究采用三种不同的诱变方法分步处理林可霉素 产生菌，促使林可霉素产生菌的DNA多基因位点发生突变，然后采用耐自身终 产物和前体物压力梯度筛选方法把高产林可霉素产生菌筛选出来。利用菌种的 自然突变，多因素低剂量的诱变效应来筛选稳定生产林可霉素的突变株作为亲 木与三重复合诱变筛选的高产菌株进行原牛质体融合，促使两亲木优良性状的 基因重组从而获得高产稳定的融合菌株。把三重复合诱变技术和原生质体融合 技术结合筛选林可霉素高产稳定菌株。 本项目完成时筛选到高产稳定融合菌株，50立升发酵罐林可霉素发酵 单位达到7000u/ml ,优化高产稳定菌株的罐上发酵工艺用于生产林可霉素。 技术原理： 自然分离的机理：多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应(据统计， 碱基对发生自然突变的几率约为10-8^10-9)造成的结果：一部份菌种退 化，也有少部分高产菌，对生产有益，简单易行，纯化菌种，防止菌种 退化，稳定生产，提高产量。 三重复合诱变的机理 染色体畸变：染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变：DNA中的碱基发生变化，即点突变。 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素有物 理的、化学的和生物的三大类。 三重复合诱变的特点：第一，诱变效率较高，即产生点突变的频率相 对较高，而染色体畸变相对较少，并且诱变范围广。因而可被用来对微生 物的某一特殊性状进行改良，并且容易出现高产的突变体。第二，出现的 突变体类型较多。尽管主要引起的是G?C—A?T碱基对Z间的转换，同时也 由于两种不同的诱变方式结合，使得突变位点增加，突变方式多样。在突 变过程中可出现其它各种类型的突变体，因而具有多效性。第三，与其它 诱变方法相比，三重诱变后产生的显性突变体相对较多，因而易于筛选突 变体。 原生质体融合技术原理 把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境 中释放出只有原牛质膜包裹着的球状体（称原牛质体）。 两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助 融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，从而实现遗传重组。在再生成细 胞的菌落屮就有可能获得具有理想性状的重组子。 获得高产优质菌株经过原生质体化与再生过程，可能得到产量提高的 细菌和链霉菌的变异菌株；种内融合还可能使抗牛素合成中的限速酶得到 修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。 4?重组菌株发酵培养基及工艺优化的原理 菌株的基因发生改变，随Z其代谢途径也会发生改变。因此，有必要 通过正交实验，来探索主要的C源（葡萄糖、淀粉）和N源（硫酸钱、黄豆 饼粉）对林可霉素产牛菌代谢的影响，从而找出诱变后的高产菌的最优培养 基配方。 项目的目的和意义 林可霉素（Lincomyci n LC）又称洁霉素，是一种高效广谱抗生素，于1962 由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得，从此获得广泛应 用。 林可霉素对革兰氏阳性菌有较强的抑菌作用，特别是对链球菌、金黄色葡萄球菌及厌 氧菌的抗菌作用尤为明显，在许多感染症的治疗中疗效显著。由于其对组织和细胞的穿透 力强，应用方便，不需做皮试，临床上用于肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌及金 黄色葡萄球菌的感染。特别用于严重厌气菌引起的感染