第7讲克隆基因表达与产物纯化-外源基因在真核细胞中表达.pptVIP

第五节 外源基因在真核细胞中的表达;酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。;CONTENTS;一、酵母基因工程;酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。;酵母菌表达外源基因的优势;B 酵母菌的宿主系统;广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌;提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 ;抑制超糖基化作用的突变宿主菌 ;C 酵母菌的载体系统;酵母菌中的野生型质粒;酵母菌中的野生型质粒;酵母菌克隆表达质粒的构建;酵母菌克隆表达质粒的构建;酵母菌克隆表达质粒的构建;酵母菌克隆表达质粒的构建;D 酵母菌的转化系统;酵母菌的转化程序 ;酵母菌的转化程序 ;酵母菌的转化程序 ;转化质粒在酵母细胞中的命运 ;用于转化子筛选的标记基因;用于转化子筛选的标记基因;E 酵母菌的表达系统;酵母菌启动子的可控性 ;酵母菌启动子的可控性 ;外源基因在酵母菌中表达的限制因素; 酵母菌表达系统的选择; 酵母菌表达系统的选择; 酵母菌表达系统的选择; 酵母菌表达系统的选择;F 利用重组酵母生产乙肝疫苗; 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母;乙型肝炎病毒的结构与性质 ;乙型肝炎病毒的结构与性质 ;乙型肝炎病毒的结构与性质 ;产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母; 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母; 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母;二、昆虫培养细胞表达系统;（2）杆状病毒的表达特点;（3）杆状病毒载体转化过程;2.最普遍应用的宿主细胞株;4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白;杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。;6.构建可持续表达的载体;三、外源基因在植物中表达;（1）Ti质粒的结构;;;;2.农杆菌的感染和生存;（2）第二步：感染植物;（6）第六步：土壤农杆菌代谢冠瘿碱;3. Ti质粒的种类;（2）胭脂碱（nopaline）型质粒;4. Ti质粒转化的对象;6. 天然Ti质粒作载体的缺点;7. Ti质粒的改造;;;;pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。 只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。;（2）双元载体（binary vectors）;② 双元载体的转化;四、在哺乳动物细胞中表达;1. 动物细胞基因克隆和表达载体—SV40病毒;（1）SV40病毒的结构;（2）SV40感染和生存方式;（3）SV40复制起始位点;（4）SV40病毒的转录和翻译;（5）SV40病毒的整合;(7) SV40基因组的改造;③重组型SV40;(8) SV40混合传染过程;(9) COS细胞