10.4总论第II部-遗传变异的创造-第十章-DNA重组4-目的基因的遗传转化.pdf

111 （续 第十章 DNA重组 3 ） 2 10-5 目的基因的遗传转化（把目的基因导入植物基因组） 把目的DNA片段整合到受体细胞核的DNA上，有生物的方法 和理化的方法。 3 一、 生物途径导入（利用土壤农杆菌） 农杆菌具有这样一个性质：一旦感染烟草，就会产生 肿瘤。农杆菌携带的质粒的一部分（T-DNA)被插入到烟 草细胞的DNA 中后，它通过植物的细胞核合成特殊的氨基 酸（章鱼氨酸、胭脂氨酸）和植物激素等，引起肿瘤的形 成（图10-5）。 通过事先把对肿瘤合成起作用的植物激素合成基因去掉，再 把其他基因整合进无害化的T-DNA中，就能把该基因导入、实 现性状改变。 Ti质粒分子量太大，难以处理。因此，一种办法是，在大肠 杆菌的质粒中，把外来基因组合进具有T-DNA的载体中，使大 肠杆菌和农杆菌结合，导入载体，载体与农杆菌的Ti 质粒之 间发生重组，外来基因被组合进Ti质粒中。 pBR322 DNA pBR322 DNA 图16-9 Ti质粒共合转化载体结构示意图 图10-2 共整合 另一种办法是， Ti质粒的T-DNA与含有控制质粒感染的基因 的DNA切离，然后分别进行克隆。把外来基因组合进含T-DNA 的质粒中，与具有感染区域的质粒一起，同时进行感染。通 过后者质粒的作用，把组合了外来基因的T-DNA插入细胞核 DNA中。这个系统就叫做双元载体（binary vector)。 让农杆菌感染植物有4种方法。第1种方法叫活体接种法，就 是把新鲜培养的土壤农杆菌接种到植株的伤口部位，从而诱 发肿瘤形成。即：先刺伤（或刀切）无菌培养出的植物的茎 ，在伤口处感染农杆菌；3~4周后，切取伤口处生出的愈伤组 织，用含有激素的培养基进行培养，选择性状转换的细胞， 再分化成植物体。 第2种方法叫共培养法，根据受体状况可分为原生质体共 培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养三种形式。在原生 质体培养过程中，细胞壁形成的时期，加入农杆菌，继续培 养。通过共培养产生感染后，用抗生物质杀死细菌，选择出 性状改变了的细胞(Marton, L. et al.,1979)。 第3种方法叫叶盘转化法，就是将受体 植物的叶片（或下胚轴、子叶、根等 ）进行表面消毒，用无菌打孔器从叶 片上取下圆形小片 （即所谓叶盘）， 然后接种上含有转移载体的土壤农杆 菌。把叶盘与农杆菌共同培养2~3天 后，为除去农杆菌，移植到含有抗生 物质的培养基上，4~5周后，分化出 芽，获得DNA重组的个体 (图10-6） 。 图10-6 图16-11农杆菌介导的植物遗传转化示意图 第4种方法叫蘸花法，就是用农杆菌菌液对受体植物花序 进行浸染或喷雾，从而获得转基因植株。该方法具有成本低 、转化率高、易重复、避开了组织培养等特点，广泛适用于 十字花科植物、番茄等的遗传转化。土壤农杆菌转化系统的 问题是组织培养时转化和再生频率低、基因型依赖性强。 利用植物病毒作为载体的方法也正在开发。现在，可