10总论第II部-遗传变异的创造-第十章-DNA重组3-目的基因重组质粒构建.pdf

111 （续 第十章 DNA重组 2 ） 2 10-4 目的基因重组质粒的构建 通过上述方法克隆得到目的基因只是为利用外源基因提供 了基础，要将外源基因转移到受体植株还必须对目的基因进行 体外重组。 3 质粒重组的基本步骤包括：从原核生物中获取目的基因的载 体并进行改造；利用限制性内切酶将载体切开，并用连接 酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。 已经分离的目的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助 质粒中，常用的有pBR322系列、pUC以及pBluescript K+(- )系列等。 在进行外源基因转移前还必须将外源基因重组到转化 载体上，具体采用哪种载体要根据转基因的方法和目的而 定。 Ti质粒(tumor- inducing plasmid) 转 化载体的结构见图 10-1 。 图 10-1 Ti质粒转化载体的结构图 pBR322 DNA pBR322 DNA 可以通过质粒的 共合转化（共 整合）法（图 10-2）将目的 基因导入到Ti 质粒中。 图16-9 Ti质粒共合转化载体结构示意图 图10-2 共整合 共整合载体系统和双元载体系统是在植物基因转化中应用最多的 Ti 质粒载体系统。共整合载体是指Ti质粒上编码致瘤基因的序 列被一段pBR322 DNA所取代，带外源基因的pBR322衍生中间 载体由大肠杆菌转入农杆菌后，两者相同的pBR322序列发生同 源重组，外源基因就此整合到卸甲质粒上。 双元载体系统是指在一个农杆菌株系中，含有两个彼此分离的质粒。一个质粒 含有从Ti质粒中剔除了致瘤基因的T-DNA 区和外源基因重组的多功能克隆载 体质粒，它既能够在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制，并能够从大肠 杆菌迁移到农杆菌中。另一个质粒是除去T-DNA后的含有Vir基因的Ti衍生质 粒。这两个载体具有协助T-DNA进入植物细胞和将外源基因及标记基因整合 到植物基因组的全部元件。