蛋白质的分离纯化幻灯片.pptVIP

举例1：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶 溶菌酶：分子量为14KD， 等电点为11， 耐热，能够水解革兰氏阳性细菌 的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。 （一）凝胶过滤： * . 纯化步骤： 150克鸡蛋壳，1％ NaCl—0.05 N HCl ,40℃抽提 ↓ 20％醋酸调pH4.6，75℃处理3分钟，离心取上清 ↓ 加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量50％的CaCl2，离心取上清 ↓ 在上清中加NaCl至终浓度5％，将样品加到Sephadex G-50层析柱中(5X25cm)，0.6% NaCl洗脱，流速40毫升/小时，收集洗脱液5ml/管 ↓ 测活，合并含溶菌酶部分 ↓ 聚乙二醇(PEG)浓缩 ↓ 结晶 * . 举例2：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3 * . Separation of a sample of test proteins on Superdex 200 HR 10/30 * . Separation of standard peptides on Superdex Peptide HR 10/30 * . Separation of the major type I collagen cyanogen bromide peptides on Mono S (二)离子交换层析 * . * . 举例：利用Phenyl-Sepharose F.F.纯化牛脑钙调素 取新鲜或冷冻牛脑100mg，加入100毫升预冷的抽提液（50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 1mM EDTA,1mM DTT, 1mM PMSF, pH 7.5）,匀浆。 ↓ 分批热处理每次20毫升，迅速升温到90℃并维持3分钟，迅速降温到10℃以下 ↓ 离心15，000rpm，30 分钟，取上清，补加CaCl2到5mM ↓ 上清加到用抽提液平衡的Phenyl-Sepharose F.F.柱上,并用平衡液洗涤 ↓ 用含有0.5M NaCl的平衡液洗涤 ↓ 用50mM Tris-Cl, 20 mM NaHSO4, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA,1mM DTT, pH7.5洗脱液洗脱 ↓ 收集洗脱峰 (三) 疏水相互作用 * . * . Isolation of a monoclonal antibody, IgG1 with Phenyl Sepharose 6 Fast Flow * . (四)亲和层析 Affi-gel Affi-Gel 10 and Affi-Gel 15 Media Affi-Gel 10 and Affi-Gel 15 affinity media provide spontaneous, rapid and highly efficient coupling of ligands via primary amines. Affi-Gel 10 and 15 gel offer Spontaneous coupling Aqueous and anhydrous coupling conditions Protein coupling completed within 4 hours at 4°C Protein coupling capacity up to 35 mg/ml gel *