蛋白质通性、纯化和表征.pptVIP

蛋白质的通性、纯化和表征;;　A． 蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用 B． 蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团，此外，还有少数的末端α-COOH, α-NH2 ， 若是缀合蛋白质，则在辅基成分中还可能包含可以解离的基团 C．蛋白质分子中可解离基团的pK‘和游离AA中相应基团的pK’值是完全不相同 D． 蛋白质可看作一个多价离子;蛋白质等电点——对某一种蛋白质来说，在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点;短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。 等电聚焦电泳：这是一种特殊的电泳，其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液，然后将蛋白质点样，只要该处的PH与蛋白质的PI不同，则蛋白质就会带电，PH值PI时，蛋白质带-电；PH值PI时，蛋白质带+电。通电后，蛋白质就会移动，直到某处的PH＝PI，蛋白质才呈电中性，不再移动，因此，可以测出PI。 ;蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，会使有规则的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从而引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。;1、变性的实质： ?次级键的断裂，所以一级结构完好 2、变性蛋白质的特点： ?生物活性丧失 ?侧链基团暴露，水溶性降低 ?易被蛋白酶水解（这就是熟食易于消化的道理） 3、变性因素： ?物理因素：加热、高压、紫外线等 ?化学因素：有机溶剂、脲、胍、强酸、强碱;变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。;3、复性： renaturation ?有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，某些蛋白质缓慢重新回复到天然构像。 ?例如，核糖核酸酶在β-巯基乙醇和8M尿素作用下发生的变性，经过透析去除尿素和β-巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来的构象，生物学活性也几乎全部恢复。 ?许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆性变性。 ;三、蛋白质的胶体性??与蛋白质沉淀; （1）蛋白质的分子大小在1 ~100nm之间，属于胶体质点的范围，在动力学上是稳定的； （2）水化层：蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等） ，具有强烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白质颗粒的表面形成一层很厚的水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集； （3）同性电荷：在非等电点时蛋白颗粒带有相同的净电荷，相互排斥，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 ; 破坏蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会凝聚成大的质点而从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。(precipitation)。 ;1、盐析法 ; 用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。; ? 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 ? 调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加加速蛋白质沉淀。 ? 常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。; ? 当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。 ? 重金属沉淀的蛋白质通常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 ? 若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。; ? pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。 ? 血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 ;? 将接近于等电点的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。 ? 加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。 ;第二节 蛋白质的分离、纯化和表征;一、分离提纯的一般程序：;（1）前处理;2). 粗级分离(常用沉淀法) ;;; 利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和盐分开。