园林植物组织培养 (13).pdf

三、Ri质粒与病毒遗传转化载体构建 1. Ri 质粒载体  发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes  存在Ri质粒:Root inducing plasmid  可完成外源基因向植物的转移工作  发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根 ，生长迅速 ，不断分枝成 毛状，故称之为毛状根/发状根 Ri 质粒 ： 200kb-800kb ，其基本结构也与Ti质粒相似，包括  致瘤区（Vir区）  T-DNA区  复制起始点（Ori ）  根据其合成的冠瘿碱种类不同，分为3类 ：  农杆碱型 Ri质粒有两段T-DNA ：TL和TR ，可分别插入植物基因组  甘露碱型 Ri质粒仅单一T-DNA  黄瓜碱型 Ri质粒仅单一T-DNA 野生Ri质粒直接可用作转化载体 Ri质粒T-DNA上基因不影响植株 再生 【Ti质粒作为载体进行基因转化时，须先解除 “武装”】  Ri转化载体构建策略  共整合载体 ： 与Ti质粒的共整合载体不同之处-直接利用野生型Ri质粒  双元载体 ： 与Ti质粒同原理-Ri质粒Vir基因反式作用驱动T-DNA转移 2、病毒载体 略 用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们重视 因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，且不 受单、双子叶限制 在大约300种特征清楚的植物病毒中 ，ssRNA病毒约占 91% ，dsRNA病毒、dsDNA病毒、ssDNA病毒各3%  植物病毒作为载体研究仍处于初级阶段—只以游离形式存在其中，而 不能整合到植物染色体上并通过有性繁殖传替后代 四、载体构建中选择标记基因和报告基因  植物遗传转化过程中，外源基因导入植物细胞的频率相当低  从未分化的细胞组织中高效选择出真正转化的细胞，须使用 标记基因：  选择标记基因  报告基因 1. 标记基因必须具备的条件 A. 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 B. 基因较小 ，可构成嵌合基因 C. 能在转化细胞中得到充分表达 D. 检测容易 ，并能定量分析 2. 选择标记基因基本特点(selectable marker gene) 2.1 其编码产物能够  使转化的细胞、组织具有对抗生素/除草剂/其他胁迫物质的抗性  或使转化细胞、组织具有代谢的优越性  从而在含有这些选择试剂的培养基中能够继续存活  进而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来 特点 ： a. 选择剂最好能抑制植物细胞正常生长 ，但并不杀死细胞 b. 标记基因表达产物应为转化细胞提供抵抗选择剂作用的能力 c. 有简便方法可检测选择标记基因在转化细胞/植株中表达 2.2. 常用的选择标记基因 1) 编码抗生素抗性 a. 新霉素磷酸转移酶基因 （卡那霉素抗性基因） b. 潮霉素磷酸转移酶基因 c. 庆大霉素乙酰转移酶基因 d. 氯霉素乙酰转移酶基因 e. 链霉素磷酸转移酶基因和壮观霉素抗性基因 f. 二氢叶酸还原酶基因 2) 编码除草剂抗性的选择标记基因 a. PPT乙酰转移酶基因 （bar ） b. 5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因 c. 乙酰乳酸合酶基因 d. 辛酰溴苯腈水解酶基因 3) 生物安全的标记基因 a. 与糖代谢途径相关的基因 • 6-磷酸甘露糖异构酶 b. 与激素代谢途径相关的基因 • 异戊烯基转移酶基因 • 吲哚-3-乙酰胺水解酶基因 c. 谷氨酸-1-半醛转氨酶基因 d. 醛脱氢酶基因 选择剂 抗性基因 抗性酶 作用机制 抗性机制 选择剂种类 Km npt II 新霉素磷酸转移酶 干扰蛋白质合成 抗生素磷酸化 抗