园林植物组织培养.pdf

二、λ噬菌体载体 1、噬菌体载体分子生物学 1 ）长度48502 bp 5’ 2 ）双链线性DNA 3 ）在两端有cos位点，可环化 cos位点（cohensive-end site ） DNA两端各有12bp粘性末端 DNA进入细菌体后， 形成双链环状DNA复制 粘性末端形成的双链区域称为cos位点 型（RF DNA ） 2、噬菌体载体的类型 野生型噬菌体具大而复杂基因组，须经改造才能用作载体 减少或增加某些限制性内切酶的酶切位点 将λ噬菌体的非必需区做部分切除 插入某种报告基因 GEM-4上带有完整的pGEM-1载体 三、柯斯质粒载体 1. 结构特点  含λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子 （包括复制起点 r r 和Amp 、Tet ) 的质粒载体  此外还具有一或多个限制酶的单一酶切位点 2. 优点  综合质粒和噬菌体载体优点，可将40kb DNA片段插入单克隆位点 利用cos序列可将整个DNA分子变成环状质粒分子 复制起始位点的存在可保证其在宿主细胞中稳定复制保存 转化的细胞可通过抗生素进行筛选  1978 CollinsHohn发明构建  1.8 kb λ DNA片段+ pBR322片段，装载范围31 - 45 kb 四、人工染色体载体 1. 结构特点 1. 两个臂，每个臂末端有一个端粒 ，而臂上有着丝点等染色体 必备元件，此外还有供选择的标记基因 2. 优点 装载能力加强，如每个YAC可装1 000 kb以上DNA片段 YAC既可保证基因结构完整性，又可大大减少核基因库所需的 克隆数目，从而使文库操作难度减少 • Artificial chromosome Yeast Artificial chromosome 酵母人工染色体 Bacterial Artificial chromosome 细菌人工染色体 3. 酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome, YAC) 3.1 特点 （1 ）只能在酵母细胞中扩增 （2 ）克隆容量大 ，为230kb-1700kb （3 ）按酿酒酵母染色体结构构建 3.2 YAC的组成结构 （1 ）着丝粒区（centromere ，CEN ） 酵母染色体着丝粒区的保守序列 （2 ）端粒（telomeres ，TEL ） 保守序列(G T ) 保护ＤＮＡ不被胞内的核酸酶降解 4 2 n （3 ）复制起点（ORI ） 约100bp的自主复制序列（ARS ） （真核生物中只有酵母菌有ARS ） TEL ORI CEN TEL 4. 细菌人工染色体载体 Bacterial artificial chromosome BAC载体可用于克隆100kb以上DNA片段 可整合到宿主染色体，在大肠杆菌染色体有30多个位点进行随机整合 优点： 拷贝数低 重组DNA为ccc质粒, 而不是线性 克隆的片段大小10-215kb, 平均100kb, 少量大于300kb 本身分子量小 ，具氯霉素抗性选择基因及多克隆位点