园林植物组织培养 (2).pdf

第二节 植物基因工程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 1、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease ） 1.1 定义与发现  能够识别dsDNA特定核苷酸序列 ，并能精确特异地切割 dsDNA内部的磷酸二酯键的一种核酸内切酶  美约翰·霍布金斯大学 H.Smith 发现流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae ）能迅速降解外源噬菌体DNA,细 胞提取液可降解 E.coli DNA,但不能降解自身DNA  即 Hind II ，III 1968分离，1978诺奖 1.2 命名 寄主菌属名第1字母和种名头2字母组成3个斜体字母略语 表示酶来源的菌种名称， 如 大肠杆菌Escherichia coli ——Eco 流感嗜血菌Haemophilus influenzae —— Hin 用一个正体字母表示菌株类型 ，比如EcoR 如一特殊的寄主菌株具几个不同限制修饰体系，则用罗马数字 标出：EcoR I、 Hind III 1.3 类型  I 型酶：识别专一核苷酸序列，并在识别点附近切割双链DNA ， 但切割序列无专一性  II型酶 ：识别位点（回文序列 ）严格专一，并在识别位点内切割 双链DNA （具实用价值）  III型酶：识别位点严格专一（非回文序列），但切点不专一 ，常 不在识别位点内部 人过大佛寺 人中柳如是 心清可品茶 信言不美 寺佛大过人 是如柳中人 茶品可清心 美言不信 II 型限制性核酸内切酶3大特点 1 ）识别位点的特异性 特定DNA识别位点，常由4、5、6或7个核 苷酸组成特定序列（靶序列） 2 ）识别序列的对称性 靶序列常具有双重旋转对称结构，即双链 核苷酸顺序呈回文结构 3 ）切割位点的规范性 双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切 割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端） Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割 EcoEcoRR II 55 ‘‘ 产生的产生的 粘性末端粘性末端 5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-G-A-A-T-TG-A-A-T-T--CC-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-GC-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’ 5’末端 EcoREcoRII 37 ℃37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 退火退火 4-7 ℃4-7 ℃