人转铁蛋白转基因小鼠整合位点研究.docxVIP

转基因小鼠鼠尾组织DNA的抽提［⑵ 小鼠生长至21天时剪取1cm尾组织置于1.5mL EP管中，加入10卩1蛋 片酶K和400卩1鼠尾组织裂解液与56。C条件下，消化16小时，屮途颠倒混匀。 加入等体积酚，振荡，混匀后BOOOrpm, 4° C,离心lOmin。 取上清液加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),振荡混匀后,13OOOrpm, 4° C,离心 lOmino 取上清液加等体积氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀后，13000rpm, 4° C, 离心lOmin o 取上清液加1/10体积3mol/L NaAC及2倍体积冰无水乙醇(于?20° C 放置1小时)颠倒混匀后，与混匀室温放置1 Omin后13000rpm离心lOmin。 80%乙醇洗二次，真空抽干后溶解于200^11 TE (pH8.0)中。 转基因小鼠的PCR检测 使用引物TF-1, TF?2扩增人转铁蛋白基因一段特异区域(630bp),引物序列 见表1-1,引物合成与上海博尚生物技术公司。检测转基因小鼠的PCR反应体系 见表1-2. 表PCR鉴定转基因小鼠所用引物序列 TF-1 5- GAGGTAGCAAGCCAATGTGT-3 * TF-2 51- TACGTGGCTCAGGTAAGTCA■丁 表1-2转基因小鼠PCR检测反应体系 10x Pyrobest Buffer 2.5 pl dNTP Mixture(each 2.5mM) 2.0 pl TF-1 (lOOng/pl) 1.0 pl TF-2 (lOOng/pl) 1.0 pl Genomic DNA (?200ng/pl) 2.0 pl Pyrobest DNA Polymerase (5U/|J1) 0.2 pl ddH2O 16.3 pl Total Volume 25.0 pl 反应 条件：94°C5min ； (94°Clmin, 55°C45sec, 72°Clmin)x32 个循环; 72°C10mino取5pLPCR产物，2%Agarose凝胶电泳检测。 1.1.3结果 转基因小鼠后代的培育 经原核显微注射法制备的转基因小鼠作为培育对象，将转基因小鼠与正常 小鼠交配后，培育形成TF转基因小鼠家系，家系图见图 F4代F0代F1代 F4代 F0代 F1代 F2代 F3代 转恳因輝鼠° 转圧因雄鼠E正常止堆鼠O 正常雄鼠口 图1-1 TFN-6转基因小鼠家系图 Figure 1-1 The pedigree diagram of human transferrin transgenic mice strain 转基因小鼠后代PCR鉴定结果 以小鼠鼠尾DNA为模板，PCR扩增hTF基因，检测外源基因是否整合。PCR 扩增完成后，取取5|JL PCR产物，120V电压下，2%Agarose凝胶电泳检测，电 泳结果在凝胶成像仪中拍照。电泳结果下图所示： N13 N 1 3 5 2 6 1 8 7 6 4 bppppppp otb)bbbb)b xo oooo o 3COOOOO o 1(036543 2 图1-2 原代转基因小鼠PCR电泳结果示意图Figure 1?2 Identifying PCR results of TF funder transgenic miceTF原代转基因小鼠：4,6,7,16,25,31; N:正常小鼠阴性对照;P： TF 阳性质粒； M: lOObp marker 图1-2 原代转基因小鼠PCR电泳结果示意图 Figure 1?2 Identifying PCR results of TF funder transgenic mice TF原代转基因小鼠：4,6,7,16,25,31; N:正常小鼠阴性对照; P： TF 阳性质粒； M: lOObp marker F1-940 F1-941 F1-944 N TFN-4 M lOOObp 800bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 图1-3 TFN-4及其后代PCR鉴定结果 Figure 1-3 Identifying PCR results of TFN-4 and offsprings TFN-4小鼠子一代：Fl-940, Fl-941, Fl-944； N：正常小鼠阴性对照 M: 1 OObp marker F1-851 F1-853 F1-854 F1-856 N TFN-6 M lOOObp 800bp 600bp 500bp 400bp 300bp 图1-4 TFN-6及其后代PCR鉴定结果 Figure 1-4 Identifying PCR results of TFN-6 and offsprings TFN-6小鼠子一代：Fl-851, Fl-853,