羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 内容与方法 挑选孕6-8周孕妇，询问病史、进行妇科检查，以确定早孕，了解子宫大小，位置、弯曲情况及胚胎着床情况 拭去宫颈粘液，严密消毒宫颈及宫颈管下段，一般可不用宫颈钳，如子宫过度前屈或后屈，则有助手用宫颈钳轻拉子宫向下固定 * 用消毒塑料吸管按子宫的自然弯曲方向，沿着子宫壁轻轻进入子宫腔，直至有阻力感为止，一般进入子宫颈外口6-10cm（根据妊娠天数及宫颈长度而定）切忌反复进退，以防剥离面大，然后用空针抽吸，同时退出塑料管，大多可吸出少许血液，绒毛枝便夹在其中 * 在无菌条件下，将绒毛组织放入玻璃平皿中，用含400U/ml双抗的0.85%NaCl反复冲洗绒毛组织2-3次以去除血液，然后除去并吸净生理盐水 * （一）消化法 （1）经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪将绒毛组织剪碎,放入装有30-50倍组织量的0.25% EDTA-trypin的三角烧瓶中，37℃下,20-30min即可 (2)将三角烧瓶中的组织溶液装入离心管，离心,1000rpm,10min * (3)去上清，加入20 ml PBS,打匀 (4)离心,1000rpm,10min (5)去上清，加入20 ml PBS,打匀 (6)细胞计数：106/25cm2接种 * (二)贴壁法 经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，在玻璃平皿用眼科手术剪剪成1-2mm3小枝或小块，移入25cm2培养瓶中，用牙科探针将组织均匀分散于培养瓶的细胞贴壁面，组织块的间距约为0.5cm-1cm,于对侧瓶壁加入含50%血清的培养基，pH为7.2-7.4，37℃培养2-3小时待组织贴壁牢固后，即可翻瓶，使组织块泡在培养液中 * (三)收获细胞及染色体制片 每天观察，一般3-7天可见上皮样或成纤维样细胞生长。根据生长情况每隔5-7天换液一次。一般培养6-20天，待细胞生长旺盛时，按下列程序处理： * 加入秋水仙素0.02-0.04ug/ml让其过夜，约14小时左右,或秋水仙素0.04-0.08ug/ml,4-6h收获 将培养液倒入离心管中，加入PBS或生理盐水2-3毫升，洗净完全培养基，加0.25% EDTA-trypsin约2ml消化3-5min，完全培养基终止消化。置离心管中离心，1500rpm ，10min * 低渗：加入0.075M KCl 4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(或0．4%柠檬酸钠1∶1作为低渗液,每管8ml，低渗10min) 预固定：加入1.5ml左右，轻混匀37℃水浴3min，离心,1500rpm,10min 固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37℃水浴15min * 室温1500rpm离心10min，去上清，约留0.5ml 重复固定：同上 离心，1500rpm，10min，去上清 视管底细胞量加入适当几滴新鲜固定剂 * 滴片：每片1-2滴, 滴片4-6张 烤片：75℃烤箱烘烤3小时 第二天行显带处理：同外周血 * 注意事项 严格无菌操作是培养成功的关键； 视细胞分裂旺盛情况加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、 4-6小时也可考虑收获； 在用0.25% EDTA-trypsin消化之前尽量将瓶壁血清洗净，更有利于快速消化； 低渗之后每一步均应轻吹打，用力过大可能损失掉较多细胞。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2．指数增生期 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。 * 指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天，细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。 肿瘤细胞由于无接触抑制