《应用酶学》第3章茶用酶的分离纯化技术.ppt

第三章 茶用酶的分离纯化技术 第一节 酶的纯化方法 第二节 酶的纯度和产量 第三节 酶的剂型与保存 6、分离及纯化 6）根据专一的亲和作用建立的纯化方法 亲和层析法、亲和电泳法。 （1）亲和层析法 亲和层析法是据生物分子间某种特有的亲和力而建立的一种新型纯化方法。 原理：酶和它的底物(包括辅助因子)、底物类似物或竞争性抑制剂通常都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶—配基络合物。因此，如果将这类配基偶联固定于样品中，那么就能迅速而有选择性地将相应的酶分子从溶液中分离出来，达到和其它杂蛋白分离的目的，这就是亲和吸附。 6、分离及纯化 6）根据专一的亲和作用建立的纯化方法 亲和层析法、亲和电泳法。 （2）亲和电泳法 亲和电泳法是将亲和层析和聚丙烯酰胺胶电泳结合在一起的高分子分离分析方法。 原理：当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶(即载体，通常多用聚丙烯酰胺)上以后，由于具有亲和作用的待分离分析成份和配基具有结合力，在电泳过程中不会移动，不具亲和性的成份将按各自的电泳速度而分离开来 6、分离及纯化 7）结晶 所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，按规则且周期性排列的一种固体形式。 由于各种分子形成结晶的条件不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是一种酶和杂蛋白分离纯化的手段。 酶的结晶过程进行得很慢，需要数天或数星期。 6、分离及纯化 7）结晶 结晶方法： (1) 盐析结晶 (2) 有机溶剂结晶 (3) 透析平衡结晶 (4) 等电点结晶 6、分离及纯化 7）结晶 为了获得纯净、粒大、收得率高的结晶应注意： (1) 酶溶液应该达到相当的纯度 除了少数例外，不纯的溶液是不能得到结晶的。 (2) 酶的浓度要恰到好处 一般以1-5％为宜，不宜小于0.2％，浓度高虽然较易结晶，但如果过于饱和，只能获得大量微晶，难以形成大晶体。 三、酶分离纯化技术 7、脱盐 (1) 分子筛 (2) 透析 (3) 超滤 三、酶分离纯化技术 8、浓缩与干燥 浓缩 真空浓缩 (2)干燥方法 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 三、酶分离纯化技术 9、保存 通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉，低温下可较长时期保存。 也可将酶溶液制成25％甘油或50％甘油分别贮于-25℃或-50℃冰箱中保存。 注意：酶蛋白浓度过稀和过浓，均不利于蛋白稳定，应保持在一定的蛋白浓度范围为好。 四、酶分离和纯化的注意事项 1.在过滤或搅拌等操作过程中，要防止泡沫的生成，以 避免酶蛋白在溶液的表面变性。 2.重金属离子对某些酶的破坏作用，在提取液中加入少 量金属鏊合剂EDTA。 3.有些含巯基的酶在分离时，往往需要加入某种巯基试 剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等，可防止酶的巯 基在制备过程中被氧化。 4.为了防止内源蛋白酶对酶的水解，在提取液加入少量 蛋白酶抑制剂。 四、酶分离和纯化的注意事项 5.大多数酶在pH4或pH10的情况下不稳定，分离纯化系统不能过酸过碱；同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 6.防止酶变性失活，尤其是在纯化的后期； 理论上说，凡是用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶。 7.通过检测酶活性可以跟踪酶的去向，为酶的分离纯化提供依据。 8.在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，了解每一步酶的回收率，纯化倍数，从而决定这一步的取舍。 第二节 酶的纯度和产量 一、酶活力测定 1．酶活力 酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。 酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示： 酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高； 反应速率愈小，酶的活力就愈低,两者呈线性关系。 测定酶的活力就是测定酶促反应的速率 第二节 酶的纯度和产量 一、酶活力测定 1．酶活力 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 在实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。 V = [p] / t [p] = v t 第二节 酶的纯度和产量 一、酶活力测定 1．酶活力 引起酶促反应速率降低的原因 (1) 底物浓度的降低 (2) 产物浓度增加加速了逆反应的进行 (3) 产物