生化实验课件：实验八 双缩脲法测定蛋白质含量.pptVIP

* 双缩脲法测定蛋白质含量 biuret method 双缩脲是尿素的缩合物，双缩脲法采用双缩脲试剂。然而，双缩脲试剂并不含双缩脲，但双缩脲及蛋白质都对铜具有相同的反应，因此，双缩脲法是一个在碱性环境中利用硫酸铜溶液来测定蛋白质含量的一般述语。双缩脲试剂由氢氧化钾(KOH)、硫酸铜(CuSO4)及酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)组成。 在碱性环境下，具有两个以上肽键的物质与双缩脲试剂中的铜离子反应，形成紫红色的络合物，颜色的深浅与肽键的多少即蛋白质含量呈正比。 原 理 双缩脲法是基于铜离子与蛋白质之间的反应。溶解于碱性溶液中的硫酸铜加入蛋白质溶液中，二价的铜被还原为一价的铜并在碱性环境中与蛋白质分子肽键中的氮形成络合物。该络合物呈紫红色， 可在540 nm波长下进行检测，吸光度与蛋白质含量成正比。 置37℃水浴30 分钟, 在540nm 波长下以0号管调零测各管吸光度 1、取8支试管，按下表操作 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 3.0ml 双缩脲试剂 — 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml 2.7ml 3.0ml 蒸馏水 3.0ml 待测蛋白 1.8ml 1.5ml 1.2ml 0.9ml 0.6ml 0.3ml — 卵清蛋白溶液 (6mg/ml) 测定管 6