14.1实时荧光定量PCR技术.pdfVIP

实时荧光定量PCR技术 (real time PCR) 常规PCR •检测 ：通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色、紫外光观察结果， 或者通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测。 •缺点 ：需要多种仪器设备，费时费力； 染色剂对人体有害； 易产生交叉污染和假阳性反应。 如果能在PCR扩增结束后不打开反应管盖即可实现扩增产物的检测， 就可以克服常规PCR扩增的这些缺点。 美国Perkin Elmer公司于1995 年开发了实时荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR • 原理：是一种核酸定量技术，通过对荧光信号的检测，实现对PCR过程中 产物量的实时监测，并可以精确计算出PCR的初始模板量。 • 应用：生物病原体检测、突变检测和多态性分析 • 优点：闭管操作，无需PCR后处理，无须对样品进行电泳 操作简单、速度快 基于这一检测原理，通过设计各种形式的探 针，发展了多种检测SNP的技术 TaqMan探针 分子信标技术 高分辨率溶解 技术 曲线检测技术 TaqMan探针技术 • 探针的5′-末端和3′-末端分别标记荧光基团和淬灭基团 ，两者能发生荧光 共振能量转移而不产生荧光。 • 在PCR反应过程中，Taq酶的5′-核酸外切酶活性将与DNA模板结合的探 针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。 • 通过检测PCR过程中或PCR之后产生的荧光信号来实现DNA模板的定量。 TaqMan探针技术测定SNP的原理 分子信标技术 • 具有PCR 技术的高效核酸扩增特性、核酸探针杂交的高特异性，以及荧 光技术的高灵敏性和可计量性。 • 广泛应用于基因变异研究、病原微生物的检测和肿瘤研究等多个领域。 • 不仅适用于体外核酸分析 ，而且也适用于活体分析。 • 可以用于蛋白质等能与核酸发生相互作用的物质分析，是一种极好的研 究蛋白质与核酸的工具。 10 分子信标技术检测SNP的原理 高分辨率熔解曲线技术 • 该技术不需要标记探针就可以快速准确地对SNP进行分型 ； • 还可用于短片段重复序列的分析、序列匹配、突变扫描、甲基 化和RNA编辑等方面的研究。 • 该技术既可用于未知SNP的分析，也可用于已知SNP的检测。 高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP的原理  通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情 况来实现。  在PCR 反应时引入饱和荧光染料，荧光染料在PCR 扩增的过程中嵌入 到DNA双链中。当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧光信号 进行采集，绘制出DNA分子的熔解曲线。  如果存在SNP 位点，则会产生SNP 位点不匹配的异源双链DNA ，该 双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上 释放，呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度（Tm值），通过专业的 分析软件可以快速确定是否存在SNP。 高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP的原理 A ：原始熔解曲线，B ：归一化后的熔解曲线。