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银杏叶提取黄酮及分离纯化 组员：李佳辉、黃埔、赵超武 一、 实验目的 1. 掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黃酮进行提取 2. 掌握紫外分光光度汁的应用，以及相关溶液的配置 3. 学会自主设计实验，培养团队合作精神 二、 实验原理 ⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且 抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用； ⑵实验需设置空口参比液，山文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为 510nm; ⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黃酮的质量浓度，因为黃酮 类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。 其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黃酮类化合物与 铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm （左右）处有 吸收峰，且符合定量分析的朗伯一比尔定律（即A二kbc） —般与芦丁标准溶液比较 定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄 酮类化合物开环，生成2-疑基查尔酮而显色。显色原理发生在黃酮醇类邻位无取 代的邻二酚疑基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黃酮类成分加入上述试剂 时是不显色的。(如二氢黃酮类化合物就不发生该显色反应) 忖前银杏叶黃酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法(SFE 法)、高速逆流色谱技术提取法(HSCCC)微波提取法、超色波提取法、酶提取法、 分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进 行大规模生产。 其工艺流程如下： 银杏叶一- 粉碎一-Na0H-60%乙醇回流提取一- 离心一-过滤一- 滤液收 集一-二次醇提一-合并两次滤液一-树脂吸附一-脱吸一-浓缩一-干燥一-提 取物 山于银杏叶黃酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线， 并采用分光光度法进行测定。 三. 实验材料及器材 1. 材料 酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇、磷酸氢二钠、 磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸 2. 相关溶液的配制和树脂预处理 0. 20mg / mL 芦丁标准溶液(500mL)、5%NaN02 (oOOmL)、10 % Al (N03)3 (500mL)、lmol / LNaOH、0. 4mol / LNaOH (500mL)、0. 4mol / L HC1(oOOmL)、 30%乙醇(500mL) 30%乙醇(1) D101树脂预处理(500g):商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应 用需要，必须进行不同深度的预处理，在提取器内，加入高于树脂层10-20厘米的 乙醇浸泡3—4小时，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗至出 口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气 味，即可进行一般使用。 (2) 芦丁标准溶液：精密称取在105°C常压干燥至恒重的芦丁对照品20吨， 置于100 mL容量瓶中，加30%乙醇约30mL,置水浴微热使之溶解，放冷，加30 %乙醇稀释至刻度，摇匀得芦丁标准溶液(0. 20mg/mL) (3) 、5% NaN02的配制：准确称取5g NaN02加入到95g蒸懈水中溶解。 (4) 、10% Al (N03)3的配制： 准确称取10g Al (N03)3加入到90g蒸惚水 中溶解。 (5) 、lmol/L立0H的配制：称取5g NaOH于一定量蒸镭水中溶解，再 定容至lOOmLo (6) 、0. 4mol/L NaOH的配制：称取1. 6gNaOH于一定量蒸憎水中溶 解，再定容至lOOmLo (7)、0. 4mol/L HC1的配制：取4ml的36. 5%的HC1溶于100ml蒸谓水中 3. 仪器 紫外可见光分光光度计、干燥箱、旋转蒸发仪、离心机、回流装置、恒温水 浴锅、中药粉碎机、容量瓶 四、实验步骤1•原料准备：称取200g银杏叶洗净，于80°C下干燥，干燥后于中药粉碎机 中粉碎，备用。 2. 黃酮的提取(银杏叶每组10g) (D-次醇提：准确称取银杏叶粉末10g,放入索是氏提取器中，用浓度为 60%乙醇溶液按1:8 (g/ml)混合均匀，在80°C下回流1. 5h, (2) 离心：在 3500r/min 下离心 lOmin； (3) 过滤：真空抽率，滤液收集； (4) 二次醇提：滤渣用浓度为60%乙醇溶液按1:8 (g/ml)混合均匀，进行二次 醇提，方法同上 (5) 合并两次滤液，将滤液置于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀释至刻 度 3. 黃酮的纯化 层析柱制备： (1) 准备：D101大孔吸附树脂预处理并充分吸涨 (2) 湿法装柱：将吸涨后的树脂与溶剂的混合物倒入色谱柱中，让其自行沉 积。(50ml) (3) 上样：将样品溶液从柱的上端以较快速度加入 (4) 洗脱：待样