高效液相色谱法基本知识培训化验员入门培训.pptxVIP

高效液相色谱法;第一节 高效液相色谱的定义及基本参数;定义 ;基本参数 ;保留时间和保留体积; 某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。 不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。而tM?FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM?FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示柱内空隙及柱外体积之总和)。; 溶质的色谱保留行为主要是由该溶质在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。 K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ?Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs 式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流动相中的质量。;调整保留时间和调整保留体积 ;容量因子(k’) ;理论塔板数n和塔板高度H ;分离因子(α)及分离度（R） ; 改变α是改变后一组分相对于前一组分的保留时间。α的改变可以选择不同的固定相或流动相来实现。但改变固定相在液相色谱中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的适应性。比较行之有效的办法是改变流动相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择性。 ; 2.分离度（R） 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品用适当的方法降解,通过测定待测组分与某一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价与控制。;无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与??他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外,待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。;计算公式为： ;首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为1≤k’≤10。;拖尾因子T ;重复性 ;第二节 化学健合相色谱; 在液相色谱中,液一液分配色谱,(liquid-liquid chromatography,LLc)具有较高的分离效能和温和的色谱条件。但最大的缺点是担体表面涂渍的有机液相容易流失,并污染分离后的组分。化学键合固定相是克服这一主要缺点而产生的。它的出现,使得以液-固吸附色谱和液-液分配色谱为主要操作模式的液相柱色谱大量地被键合相色谱所取代,某些离子型化合物也改用了离子交换键合相或反相离子对色谱进行分离。因而,化学键合相色谱是现代液相色谱中的一个重要方法。;特点 ; （二）耐溶剂冲洗 这是传统的液-液分配色谱逐渐被键合相色谱(bonded phase chromatography,BPC)取代的根本原因。在现代液相色谱发展的初期,常和气相色谱一样,把有限的几种固定液,例如β、β’-氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等涂渍的担体表面上,用一种性质相差很大的溶剂冲洗,进行LLC分离。由于两种完全互不相溶的溶剂体系实际上几乎不存在,因而在LLC中固定液相的流失就十分严重。为了克服这个缺点,曾采用流动相预先被固定液饱和,以及柱前增加预饱和柱的方法,但这样做既不方便,柱系统的稳定性也差。化学键合相是通过化学反应将有机分子键合到担体上,因而具有不可抽提性,也就是不存在固定液流失问题,使得柱寿命大大延长,并且扩大了可用溶剂的范围。 ; （三）热稳定性好 这一点在气相色谱中很重要。每种固定液有最高使用温度。例如十八烷作为固定液时,只能在常温下使用