仪器分析和波谱原理8高效液相色谱法.pptxVIP

第14章 高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography, HPLC;定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法。 高效液相色谱法（HPLC）：20世纪60年代末70年代 技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器 特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化; 2．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 （1）高压：供液压力和进样压力高达（1.3~3.5）×107Pa。带有自动进样装置和工作站。 （2）高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。 （3）???效：HPLC高压(2~6 MPa)下操作，填料颗粒小(2~50 ?m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=4000~60000 块/m)，分离效率高。 （4）高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达10-11~10-13 g。;3．高效液相色谱法与气相色谱法的比较 （1） 适用范围 GC适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物，HPLC不受此种限制，可分离高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物（75%~80%）。气相色谱一般都在较高温度下进行，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 （2） 流动相 GC流动相仅运载样品，不起分离作用，但无毒，易于处理。而HPLC流动相除了运载样品外，还有分离作用，可改变流动相组成和极性，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费用高。;（3） 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效很高(理论塔板数N=104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N=103~104)，低于GC柱。 （4） 检测器 与GC相比，HPLC检测器种类较多。 （5） 制备色谱 GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。HPLC可进行制备，即制备色谱。;;一、液－液分配色谱法 二、液－固色谱法 三、离子交换色谱法 四、离子对色谱法 五、空间排阻色谱法 六、离子色谱法;一、液－液分配色谱 原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。;2. 流动相 根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱和反相分配色谱。 正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，适于极性组分分离，极性小的先流出。 反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，适于非极性组分分离，极性大的先流出。;正相色谱;3. 固定相 原则上，用于气相色谱的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有几种，按极性由高到低为：?,?’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鲨烷（SQ）。 早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。;二、液－固吸附色谱 是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。 以固体吸附剂为固定相，如极性的硅胶、氧化铝、分子筛和非极性的活性炭等（较常使用5－10nm硅胶微粒）。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 宜于分离极性不同或含极性基团相同但数目不同的试样，也适于分离异构体，但不宜于分离同系物。 ;三、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。 1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。;2. 固定相 按离子交换剂类型分四种：;微孔型 大孔型;3. 流动相 离子交换色谱流动相为无机酸或无机碱的盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。;四、离子对色谱法（IPC） 主要用来分离强极性有机酸和有机碱。 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成疏水型离子对AB，该AB离子对的性