临床生化检验：丙氨酸氨基转移酶测定 （速率法 ）.ppt

丙氨酸氨基转移酶测定 （速率法 ） 丙氨酸氨基转移酶 丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称为谷丙转氨酶（GPT）。是转移酶类的一种，能催化双底物分子之间基团的转移，将供体分子基团或辅酶转移给受体分子。 主要存在于各种组织细胞中，以肝细胞中含量最多。正常时只有极少量释放入血液中，故血清ALT活性很低。各种肝炎的急性期，药物中毒性肝细胞性坏死等疾病时，肝细胞酶大量释放入血中，使血清ALT活性显著增高，因此它是诊断病毒性肝炎，中毒性肝炎等肝病的重要指标。 分析方法分类 终点法 一点终点法 二点终点法 固定时间法（两点法） 连续监测法（速率法） 透射比浊法 连续监测法（速率法） 是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2～60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。 是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（△A/min）计算结果。 实验目的 通过对ALT测定，掌握NADH负向反应法测定的基本原理，以及该测定法的注意事项； 掌握单、双试剂测定ALT的原理和方法； 熟悉ALT连续监测法测定的优缺点和方法学评价； 了解利用NADH负向反应法测定其他项目的基本原理。 实验原理 上述偶联反应中， NADH被氧化为NAD+ ， NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，在340nm波长处，NADH呈现特征性吸收峰，而NAD则没有。因此，可在340nm处连续监测到NADH的消耗量（即吸光度的下降速率-△A/min ），从而计算出ALT活性浓度。 反应式 试剂与器材 R1试剂： Tris缓冲液 100mmol/L L-丙氨酸 500mmol/L 乳酸脱氢酶(LDH) ≥ 2000U/L NADH R2试剂： α-酮戊二酸 15mmol/L 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 0.18mmol/L 标准液：79U／L 病人血清 紫外分光光度计 样品要求 样本为空腹血清、血浆（肝素抗凝、EDTA抗凝） 样本应在低温条件下运输保存，样本中ALT在2℃～8℃可稳定3天。 红细胞ALT比血浆高约7倍，溶血时红细胞内ALT可进入血浆，导致测定结果偏高，故避免溶血。 操作步骤 加入物 B S U 蒸馏水 240μl - - 标准液 - 240μl - 血清 - 240μl 试剂R1 3ml 3ml 3ml 混匀，25℃室温放置5分钟 试剂R2 750μl 750μl 750μl 混匀，室温25℃放置1分钟后，在波长340nm处，以B管调零，并计此时为0点或起点，测定初始吸光度值，等待，再测定1分钟后、2分钟后、3分钟后的吸光度值，然后准确测定平均每分钟吸光度变化值△A/min。 取3支试管做好标记，按下表操作： 数据处理计算 管号 测定时间 平均△A/min 第0分钟 第1分钟 第2分钟 第3分钟 S U 计算 参考值 男：（5～40）U/L 女：（5～35）U/L 临床意义 ALT常作为判断肝细胞损伤的灵敏指标。 1、急性病毒性肝炎，可观察病情发展，作预后判断。 2、慢性病毒性肝炎或脂肪肝，正常或轻度增高。 3、肝硬化、肝癌时，ALT轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死。 4、其它原因引起的肝脏损害、骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起ALT增高。 方法学评价： 血清中也含有酮酸及谷氨酸脱氢酶(GLDH)，可以消耗NADH而使测定结果偏高，即存在以下两个副反应： 两个副反应 血清中存在的α-酮酸（如丙酮酸）能消耗NADH： 血清中存在谷氨酸脱氢酶（GLDH）增高时，在有氨存在的条件下，亦能消耗NADH： 实验原理 对策： 采用过量的NADH（终浓度0.14～0.2mmol/L），将血清同不含α-酮戊二酸的所有试剂一起预温，使其他副反应充分进行，再加入α-酮戊二酸以启动酶反应，监测光吸收的变化，可完全排除这种干扰。 性能指标 1、线性范围：0-400U/L范围内，剂量-反应曲线线性相关系数应不低于0.9900 2、准确度：误差≤±10%