在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时,应注意以下几个问题.pdfVIP

1．如果蛋白质 -SDS 复合物不能达到 1.4 克 SDS/1 克蛋白质的比率并具有相同的构象， 就不能得到准确的结果。影响蛋白质和 SDS 结合的因素主要有以下 3 个：（ 1）二硫键是 否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下， SDS 才能定量地结合 到蛋白质分子上去， 并使之具有相同的构象。 一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还 需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。（ 2 ）溶 液中 SDS 的浓度：溶液中的 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍 以上。（ 3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26 ，因为 SDS 在 水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的， SDS 结合到蛋白质分子上的量，仅决定于 平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度， 在低离子强度的溶液中， SDS 单体具有较高的平衡 浓度。 2 ．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围， Weber 的实验指出，在 5% 的凝胶中， 分子量 25,000 — 200,000 的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在 10% 的凝胶 中，10.000 — 70,000 分子量的蛋白质呈直线关系； 在 15% 的凝胶中， 10,000 — 50,000 分子 量的蛋白质呈直线关系； 3.33% （以上各种浓度的凝胶，其交联度都是 2.6% ）的凝胶可用 于分子量更高的蛋白质。 可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品 相近的蛋白质作标准蛋白质。 标准蛋白质的相对迁移率 （蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁 移距离即为相对迁移率，详见后）最好在 0.2 — 0.8 之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项 条件控制得完全一致，因此，用 SDS- 凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标 准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 3 ．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如 α-胰凝乳蛋白酶）组 成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白 质，SDS- 凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量， 而不是完整分子的分子量。 为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与 SDS- 凝胶电泳的结果互相参照。 4 ．不是所有的蛋白质都能用 SDS- 凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这 种方法测出的分子量是不可靠的。 这些蛋白质有： 电荷异常或构象异常的蛋白质， 带有较大 辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白 F1 ，它本身 带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的 SDS ，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影 响，它的分子量是 21,000 ，但 SDS- 凝胶电泳测定的结果却是 35,000 。因此，在分析 SDS -凝胶电泳所得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相 验证。为了判断待测样品是否可用 SDS- 凝胶电泳法来测定分子量，也可以使蛋白质