植物细胞培养及次级代谢产物制备.pptVIP

;;第一节 植物细胞培养的特点;;与微生物细胞相比，植物细胞有什么特点？;;（1）单细胞分离; 酶解法;由愈伤组织诱导分离单细胞;;（2）植物单细胞小规模培养;看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。;;饲养层培养将饲养细胞先用射线辐射处理，使其失去活性，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞能够起到一个饲养作用。;双层滤纸植板培养方法;;概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。?;微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。;;微室培养特点：①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程。②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。; 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态。;①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。 ②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。;无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。 如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。 用于处理的细胞系最好处于对数生长期。;细胞系和细胞株;;;;植物细胞大规模悬浮培养(cell suspension culture);意义/优点;Cell suspension;细胞悬浮培养起始培养物的建立;建立细胞悬浮系;悬浮细胞的生长与增殖;悬???培养细胞数目的增殖变化;细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）: 细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少； 静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。;;;植物细胞悬浮培养的生物反应器—自学;植物细胞规模化培养方式;;? 植物细胞固定化需要采用固定剂，是一些多糖和多聚类化合物，常用的包括海藻酸盐、琼脂糖、卡拉胶等。; ?常用方法： （1）滴入法：将细胞悬浮液与灭菌的含NaCl的卡拉胶溶液混匀，然后滴入含中KCl的培养基中，使其分散成小颗粒。过滤、清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。 （2）模铸法：将细胞-卡拉胶溶液注入柱形铸模中形成颗粒。 （3）两相法：将细胞-卡拉胶溶液与无菌豆油或石蜡油搅拌混匀，形成液滴置于冰浴中不断搅拌，凝固成均匀颗粒，再离心除去油相和大部分溶液。; ?琼脂糖(Agarose)固定化： （1）凝块法：将细胞悬浮于灭菌的琼脂糖中，搅拌待凝结包埋细胞后，将凝块挤进无菌金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。 （2）模铸法：同卡拉胶法 （3）两相法：同卡拉胶法 ?优点：与海藻酸盐、卡拉胶等固定化方法相比，不需要其它离 子来保证胶的稳定性。 ?不足：制得的颗粒较大、形状不规则。; ?固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有： （1）荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。 （2）呼吸强度测定： 用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。 （3）细胞生长速率的测定： 通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。;第三节 植物细胞培养生产次级代谢产物;概述;细胞代谢产物分为初级代谢产物、次级代谢产物。 初级代谢产物（Primary metabolites） 是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。 次级代谢产物（Secondary metabolites）是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。 大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。植物次生代谢产物次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。;; 由于资源短缺和需求量增加，依靠从