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植物细胞培养及原生质体培养 球根鸢尾原生质体培养和植株再生（图片引自Euphytica，1999，105: 99–102） 针叶石竹叶片原生质体培养及植株再生（图片引自In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 2005, 41:794–800） 仙客来原生质体培养及体胚途径再生（图标引自Plant Cell Tiss Organ Cult, 2010, 101:171–182） 一、原生质体培养的意义 （1）原生质体可以作为体细胞无性系变异和突变体筛选的材料； （2）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)； （3）原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。 （4）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。 （5）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。 自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。 (一) 原生质体的制备： 1、材料来源与预处理： （1）材料来源： 可以采用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。 （2）预处理： A.预质壁分离：17-20 ℃ 酶液中静置半小时，再于28—34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的； B. 预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高； C. 暗处理: 将室温下生长5—7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力； D.光处理: 将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离； E.低温处理: 夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。 2. 制备原生质体的酶类： 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。 （引自K.-H. Neumann et al., Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology, Principles and Practice, ? Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2009） 常用的酶类有： A. 纤维素酶（Cellulase ），如Onozuka R—10及RS，国内常用的为EA3—867，其中含少量果胶酶； B. 果胶酶（Pectinase ），如Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1％，悬浮细胞为0．05％； C. 崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； D. 半纤维素酶（Hemicellulase），如Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生质体的分离; E 蜗牛酶（Snailase），是一种混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶主要用于体细胞原生质体分离。 酶液配制： 需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0. 1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4 (0. 75mmol/l)等渗透稳定剂，以维持原生质体完整性。 酶液pH值相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜，降至4．8以下则原生质体破裂。酶液配制后需以0.45 um微孔膜过滤除菌，而不可采用加热灭菌法。 3．原生质体分离及纯化 （1）分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法，前者产量极低而不多用、后者又分—步法及二步法。 一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理2—24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放原生质体。 （引自K.-H. Neumann et al., Plant Ce