第五章目的基因的获取.pptVIP

其主要特点是合成全长 cDNA 的比例较高，但操作比较复杂，形成的 cDNA 克隆中都带有一段 Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。 .cDNA与载体连接 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、 酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4: DNA binding domain Active domain N C 1-147aa 768-881aa 上游激活序列（UAS） 转录激活 GAL4效应基因 结合 结合 激活转录 实验发现： 转录表达 只要DNA binding domain（DNA-BD） 与Active domain（AD）靠近就能激活转录。 2. 拆开 Domain DNA binding domain Active domain 上游激活序列（UAS） 转录激活 GAL4效应基因 结合 用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。 不能转录 3. 重组Domain 用重组DNA技术把这两个Domain分别与两个不同的多肽连接。 Active domain 蛋白A 蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A与蛋白B是否能结合。 4. 观察报告基因表达 GAL4的DB domain与AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。 （1）如果蛋白A与蛋白B不能相互结合 （2）如果蛋白A与蛋白B能相互结合 上游激活序列（UAS） 转录激活 GAL4效应基因 蛋白A DNA binding domain 转录激活domain 蛋白B 激活转录 转录表达 X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。 Reporter gene表达就说明X基因产物与Y基因产物能结合。 双杂交原理 重组质粒构建过程 构建好的两质粒载体 Trp- Leu－ 报告基因表达情况 构建的质粒转到酵母均株中，根据筛选标记获得阳性植株 八、生物信息技术分离和鉴定目的基因 1、利用EST数据库发现新基因 EST：基因表达的短的cDNA序列，包含基 因编码区的部分信息，称为表达序列标签。 利用EST数据库发现新基因也被称为基因 的电脑克隆。 GenBank的EST数据库中已收集了EST序 列2,020,608条. 2000年，夏家辉用EST方法发现了神经性耳 聋基因. 2、通过蛋白家族的保守性分离目的基因 (1)利用序列同源性比较软件(如B1ast软件)将待进行延伸的序列(以下简称种子序列)对库检索； (2)从数据库中挑选出全部相关序列； (3)对所有序列进行片段整合分析(即Contig分析)，形成延伸后的序列(简称新生序列)。随后，此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能够被进一步延伸为止。 作业： 1、说明获取目的基因方法的选择策略。 2、酵母双杂交分离获得目的基因的原理与过程？ 3、详细介绍两种获得差异表达基因的方 4. 什么是基因组文库(genomic library)?构建基 因组文库，涉及哪些基本过程? 5. 什么是cDNA文(complementDNAlibrary)? 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。 二氧化硅 * Diisopropylamino 将亚磷酸酰保护的核苷酸单体和四氮唑活化剂混合形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体，3端被活化。 * 盖帽，加入乙酰苷封闭没有反应的1核苷酸的－OH。 化学合成法合成的片段为150－200bp，多数基因都超过了这个长度。 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。 2010年月 美国64岁科学家 10年耗资4000万美元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因后导入到之原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进行复制。 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大