基因定位常用的方法.pptxVIP

基因定位常用的方法第1页/共41页遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。第2页/共41页一、基因定位的方法1、体细胞杂交法基因定位：体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。1）体细胞杂交的概念： 也称细胞融合（cell infusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell），含双亲不同的染色体。第3页/共41页 2）对象： 人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠 3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。第4页/共41页4）原理： 细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。第5页/共41页HAT选择系统： 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料第6页/共41页因此在HAT培养基上 人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍） 第7页/共41页鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成） 第8页/共41页 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。第9页/共41页TK-HPRT+TK+HPRT-人鼠X鼠人鼠人HATTK+鼠人17 3TK+TK+HPRT+173TK-17 3第10页/共41页②克隆嵌板法(clone panel method) 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。 克隆嵌板 杂种克隆 保留的人染色体 1 2 3 4 5 6 7 8 A + + + + - - - - B + + - - + + - - C + - + - + - + -第11页/共41页2.原位杂交和荧光原位杂交 1）原位杂交（in situ hybridization）：是最直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于11p15。 2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部分。第12页/共41页3）原位杂交的特点： 杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。4）原位杂交的步骤第13页/共41页 制备中期染色体 DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上） 洗膜 放射性标记：放射自显影 检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 记录杂交信