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2021年琼脂糖凝胶电泳实验报告 2021年琼脂糖凝胶电泳实验报告 PAGE / NUMPAGES 2021年琼脂糖凝胶电泳实验报告 试验一: 琼脂糖凝胶电泳对DNA提取 试验目: 学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA提取。 试验原理: 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙固体基质特征。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。依据DNA分子量不一样, 采取外加电场使其分开, 用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。1）在电场作用下及中性pH缓冲条件下, 带负电核酸分子向正极迁移。因为糖——磷酸骨架在结构上反复性质, 相同数量双链DNA几乎含有等量净电荷, 所以它们能以一样速度向正极方向移动。2）在一定电场强度下, DNA分子迁移速度取决于分子筛效应, 即DNA分子本身大小和构型。含有不一样相对分子质量和不一样构型DNA片段泳动速度不一样, 可进行分离。3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光, 当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时, 生物染料从正极向负极移动, 就会嵌入DNA分子中形成络合物, 使DNA在紫外光下发射很强荧光。在生物染料足够情况下, 荧光强度正比于DNA含量, 这么就能够检测DNA浓度。 试验材料: 微量移液器(2μl和4μl), 高压灭菌锅, 电泳仪, 琼脂糖平板电泳装置, 微波炉等。TAE电泳缓冲液 , 琼脂糖凝胶, PCR扩增样品 试验步骤: 1胶液制备: 称取0.2g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中, 加入20ml TAE稀释缓冲液, 放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化, 沸腾。取出摇匀。加热时应盖上封口膜, 以降低水份蒸发。 2胶板制备: 将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)紧密封住。将封好胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子。 3向冷却至50-60℃琼脂糖胶液中小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀胶层。检验有没有气泡。 4室温下约20分钟后, 琼脂糖溶液完全凝固, 小心垂直拔出梳子和挡板, 注意不要损伤梳底部凝胶, 清除碎胶。将凝胶放入电泳槽中。 5加入电泳缓冲液（TAE）至电泳槽中, 使液面高于胶面约1mm。 6加样: 取2μlPCR样品与2μl 缓冲液液混匀, 用微量移液枪小心加入样品槽中。小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。7电泳: 加完样后, 插上导线, 打开电泳仪电源, 根据需要调整电压至160V, 电泳开始, 观察电流情况或电泳槽中负极铂金丝是否有气泡出现。8当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时, 将电压（或电流）回零, 关闭电源, 停止电泳。9取出凝胶, 在紫外观察仪上观察电泳结果。在波长为302nm紫外灯下拍照观察。 试验结果: 利用琼脂糖凝胶电泳试验做图以下: 结果分析: 经过跑胶结果能够看出DNA分离效果都很好, 无断裂, 浓度可观, 点样位置为第一排第16个, 即第一排最终一个。与Mark对照有相吻合条带, 可进行下一步判定与分析。 注意事项 1确保试验全程无污染 2缓冲系统: 在没有离子存在时, 电导率最小, DNA不迁移, 或迁移极慢, 在高 离子强度缓冲液中, 电导很高并产热, 可能造成 DNA变性, 所以应注意缓冲液使用是否正确。长时间 高压电泳时, 常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液循环是可取。 ? 3凝胶制备: 凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中相一致, 溶解凝胶应立刻倒入板中, 避免倒入前凝固结块。倒入板中凝胶应避免出现气泡, 影响电泳结果。 ? 4样品加入量: 加样量多少依据加样孔大小及DNA中片段数量和大小而定, 过多量会造成加样孔超载, 从而造成拖尾和弥散, 对于较大DNA此现象更显著。 ? 5电泳系统改变会影响DNA迁移, 加入DNA标准参考物进行判定是必需。