植物内生菌DNA提取方法.docVIP

(完整word版)植物内生菌DNA提取方法 (完整word版)植物内生菌DNA提取方法 PAGE PAGE3 (完整word版)植物内生菌DNA提取方法 PAGE 在提取植物内生菌之前，植物需要外表灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1min，再将植物浸泡在70%酒精中1min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s〔林格氏液〕清洗3次，每. 1min。根和茎〔土外表以上1cm处〕都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。 植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤〔方案一〕，或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞〔方案二〕。 东南景天外表灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30min，用蒸馏水洗3次，每次3min。用吸水纸吸去植物外表水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与 植物地上局部开。将根系用70%酒精浸泡2min，无菌水洗3次，3%NaClO浸泡2次，每次1min，然后用无菌水冲洗3次，每次2min，最后一次清洗液涂 LB平板。 将2g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5mL磷酸钠缓冲液〔19.9gNa2HPO4·H2O，1.27gNaH2PO4·2H2O，H2O定容到1L〕研磨至匀浆。 将植物匀浆转移至50mL无菌离心管中，摇床200rpm振荡1-2h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。 取4mL悬液于新的无菌离心管中，12000×g离心10min收集菌体细胞。 4.弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL1×TEbuffer〔Tris-EDTA；pH8〕中参加10mgmL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。 参加50μL20%SDS和8μL20mgmL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h， 期间轻轻上下颠倒混匀数次。 参加200μL5MNaCl，涡旋振荡15s，12000×g离心10min。 7．取上清液，并向上清液中参加等体积的 氯仿-异戊醇〔24:1〕，彻底混匀， 12000×g离心10min。 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。 9.上清液转移至新的无菌离心管中，参加丙醇，4℃放置1h。  0.6倍体积〔0.6vol〕的冰冷的异 4℃，12000×g离心10min，弃上清。 沉淀用70%冰乙醇清洗，离心，弃上清。 DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。 13.DNA纯化采用TIANquickMidiPurificationKit 。 微生物16SrRNA基因V5-V6-V7区域扩增引物： 799F2：GATGGCCATTACGGCCNNNNNN 1193R：ACGCATCCCCACCTTCCTC 用含10%SDS提取缓冲液(NaP缓冲液)重新悬浮细胞团块。用直径0.11mm的玻璃珠珠打操作50s，以溶解细胞。用苯酚-Tris(pH8)溶液和氯仿/异戊醇提取，用0.6vol的异丙醇和0.5mol/LNaCl通过沉淀再次获得DNA。用70%的乙醇洗涤细胞团块，真空枯燥，再溶解在50μl的超纯水中。原始DNA提取物用Glassmilkpurificationkit(Bio101,LaJolla,CA)进一步纯化。 所需试剂：Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10%SDS〔十二烷基硫酸钠〕， Tris饱和酚，氯仿 /异戊醇〔体积比 24:1混合〕，异丙醇，0.5mol/LNaCl，70%乙醇。 苯酚、氯仿、异戊醇在 DNA提取时的作用 抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？ 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去， 使蛋白失去水合状态而变性。经过 离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相别离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保存在最下层。作为外表变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这局部水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二 次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合〔1:1〕使用。 为什么用酚与氯仿抽提 DNA时，还要加少量的异戊酵？ 在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。参加异戊醇能降低分子外表张