色谱常见问题摘选及故障排除：3-色谱问题摘选分享（一）.pptVIP

* * * * * * * * * * * 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 INNER MONGLIA MENGNIU DAIRY (GROUP)CO.,LTD 色谱问题摘选分享（一） 1、请问怎么测量有机流动相的pH值? 流动相的pH值一般指不含有机溶剂的pH值，因为在实际过程中，由于色谱柱的不同，最佳分析流动相中有机溶剂的比例也不同，不同溶剂混合后pH值会有一定的变化。在有机溶剂中甲醇偏酸性，乙腈偏碱性。 一般表示流动相的pH值是采用流动相中水相的pH值。在文献中也有混合有机溶剂流动相的pH值，但严格讲，此时不能简单地叫pH值，而叫做表观pH值。其测定也是用普通pH计。 2、三乙胺在液相色谱流动相中有什么作用? 三乙胺是改性剂，通常加在反相或离子对流动相中，主要的作用是减少样品中碱性组分的拖尾。因为C18键合相上残留的硅羟基容易与碱性化合物结合而造成峰拖尾，所以，在流动相中加入碱性的三乙胺后可以首先与硅羟基结合，从而阻碍了样品中碱性化合物与硅羟基的作用，减少了峰拖尾。一般用量在10~20mmol/L或流动相体积的0.1%~3%。在实际使用过程中，一般不单独使用碱性三乙胺，而是与其他试剂组成缓冲体系。 3、长时间分析中如何保证保留时间不漂移？ 仪器的稳定性：泵流量、渗漏、堵塞、比例阀等 温度恒定：柱温设置不宜过高，且与外面的温差要小； 流动相：密封性、恒温、比例高； 平衡时间：需要平衡足够的时间； 方法的稳定性：流动相的pH与样品的等电点相差2个单位以上； 色谱柱：质量好、冲洗干净、对流动相稳定； 样品：溶解在适当的溶剂中、样品的所有组分在下一次运行前全部洗脱出色谱柱。 4、标准溶液和样品中的同一物质的出峰时间并不一致？ 通常保留时间应该是一致的； 但是样品中有很多杂质的话也会有影响； 物质在样品中的存在形式同标准溶液中或许有不同，或者是样品溶剂与流动相和对照样溶剂差别较大； 为了确证这种情况，可以将两种溶液混合，看看出峰时间是否一致，如果不一致，就要设法解决。 5、保护柱和预柱的区别？ 保护柱叫Guard Column，装在分析柱前，进样器后，填料性质应与分析柱相同或相近，只是颗粒的直径大一些，主要是保护分析柱不被样品中的强保留杂质或颗粒物污染。 预柱叫Pre-Column，应该装在泵后，进样器前，起到饱和流动相和过滤杂质的作用（过去的硅胶填料对流动相要求较高，超出2~8的pH范围后填料会溶于流动相中，预柱就是牺牲其中的填料来饱和流动相，以保护分析柱）。 6、怎样选择固相萃取柱的大小？ 根据样品量的多少来确定，见下表： 样品量 萃取柱的大小 1ml 1ml 1~250ml，且不要求萃取速度 3ml 1~250ml，要求快萃取速度 6ml 10~250ml，要求高样品容量 12ml、20ml或60ml 1L，且不要求萃取速度 12ml、20ml或60ml 100ml~1L 47ml 1L，且要求高样品容量 90ml 7、流动相中可以加什么酸？ 三氟乙酸：酸性强，用于对流动相挥发性、紫外吸收和酸度有较高要求的体系中，如因为三氟乙酸的挥发性好，在用ELSD检测等情况时常必需；三氟乙酸与醋酸的紫外吸收不同。三氟乙酸的透光性较好，但腐蚀性较大，用于蛋白质、核酸类分析较多； 高氯酸：调节酸性能力较强，可作为离子对试剂使用； 醋酸：很多情况下使用，调节酸性能力平缓，酸性较弱，对色谱柱的影响比较小； 磷酸：可以抑制酸性物质的水解，紫外吸收小，用紫外检测时，有助于提高信噪比。容易长霉； 硫酸：实际效果相当于磷酸，不能用于LC-MS； 甲酸：酸性比醋酸强，比其他酸弱，常用于LC-MS流动相的添加剂。 8、甲醇水作梯度分析时为何比乙腈水漂移大？ 甲醇的紫外截至波长为205nm，水为200nm，乙腈为190nm，因此一般情况下作梯度分析时甲醇水比乙腈水造成的基线漂移大。随着检测波长的提高，飘移会变小，尤其是甲醇水系统。因此，在梯度分析时，如果在较低的波长，用乙腈比较好，如果用甲醇，那么变化范围不易过大，同时要注意水的纯度和色谱试剂的可靠性。 9、毛细管柱进样口石英衬管中的硅烷化玻璃棉的作用是什么？ 填充硅烷化石英玻璃棉可增大进样口内接触样品的表面积，加速样品汽化，且使样品汽化更均匀；可以防止注射器针尖的歧视现象，还可以避免颗粒物质堵塞色谱柱。对极性样品的分析特别有效。 10、程序升温达到最高温度时总是出现一个很大的峰，为什么？ 有两种可能：一种是色谱柱流失；二是样品中的高沸点组分； 处理的方法：不进样，空走程序升温２～３次，如果现象消失，则多为样品问题，如果现象依旧则多为系统问题。 另外，进样垫选用质量好的，否则进样针头容易将橡胶碎屑带入汽化室，高温时会有增塑剂挥发出来，或者橡胶降解产生挥发性化合物，日久可能导致色谱柱堵塞。有隔垫吹扫的仪