第十四章基因重组和基因工程.pptxVIP

生物化学考试前答疑时间：本周四、周五进行。地点：生化楼具体安排请到生化楼看通知。; DNA重组和重组DNA技术 DNA Recombination and Recombinant DNA Technology;第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature;;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。;Holliday模型的4个关键步骤： ;3′;5′; 内切酶 (recBCD);片段重组体 ： 重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;Holiday中间体;二、细菌的基因转移与重组有四种方式;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合； 细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP) 都含有相同的核心序列，称为O区，该区由15bp组成： 5’GCTTTTTTATACTAA3’ 3’CGAAAAAATATGATT5’;反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。;（二）细菌的特异位点重组;hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。; H2鞭毛素;（三）免疫球蛋白基因的重排;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 ;;四、转座重组;插入序列(IS) 是从细菌的乳糖操纵子中发现了一段自发的插入序列，阻止了被插入的基因的转录，所以称为插入序列(IS)。 转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代10-6一10-7。 ; 插入序列(insertion sequences, IS)组成：;插入序列发生转座的形式：;插入序列的复制性转座;转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。; 细菌的可流动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L;由转座子介导的转座;第二节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;应用酶学的方法，在体外将目的片段与载体DNA连接，形成成一具有自我复制能力的重组DNA分子，继而在宿主细胞进行复制、扩增，从而获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ; 工具酶 目的DNA片段 载体DNA 宿主细胞;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;Ⅰ型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用；通常其切割位距离认知位可达数千个碱基之远。;Ⅲ型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。 ;生理意义：;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DN