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临床微生物检测的基因同源性分析 ??????医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染 监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有 效预防和控制措施，从而防止医院感染或者爆发流行，因此对微生物鉴定和菌株 同源性分析提出了更高的要求。 ??????目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断 和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来 愈重要了。近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应 用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和 快速。细菌DNA?同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反响、DNA?探针 杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细 菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重 要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。 ?一、质粒分型（Plasmid?profile?assay）: 1、原理： ?????质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丧失或者被宿主稳定地获得，因 此流行病学上相关的别离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。把质粒提取出来, 进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道别离菌株携带质粒的大小和数目。 3、实验方法的评价： ???优势： ?????????a.步骤比拟简单，对实验仪器要求不高。 ?????????b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）别离 出来的菌株非常有效。 ???缺点: ??????????a.实验结果的重复性不好。 ??????????b.分辨力不高 ?二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析 （Restriction?Endonuclease?Assay?REA） 1、原理： ■■■????限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA, DNA被消化后, 所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。 在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸 酶消化细菌的DNA,这样就会得到成百上千条长度在0. 5-50Kb范围内的DNA片 段。恒定的电场琼脂糖电泳，可以根据分子质量的大小将这些DNA片段分开，然 后通过EB染色并在紫外灯下观察其图谱。同一种的不同别离菌株的DNA序列的 变异可造成限制性位点数目和分布的变化，所以可以导致其REA图谱出现差异。 ■■■ 2、 实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA （主要是Hind? 染色、凝胶成像。 3、 实验方法的评价： ??优势：？ ???????a.实验流程简单。 ???????b.所有的菌株都可以这个方法来分型。 ???缺点: 一些条带可???????a. REA图谱包括成百上千条带，一些条带可能不能检测到, 一些条带可 能会重叠。？ ???????b. REA图谱分析复杂。 ???????c.分辨力不高。 三、染色体 DNA 的脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field?Gel?Eelectrophoresis?PFGE） 1、原理： ????用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大量的、 壬叠的、分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。如果用限制性位点 相对少的酶消化细菌的基因组，那么就可以得到数量相当少但更大的限制性片 段，这样在电泳中，穿过琼脂糖的电场作周期性的改变，就可以产生一个有5-20 条清晰的分辨较好的图谱。 2、 实验流程：a.染色体DNA抽提；b.限制性内切酶消化DNA （主要是Xbal）； c.凝胶电泳（脉冲场；d. EB染色、凝胶成像；e.软件分析。 3、 实验方法的评价： ??????优势: ??????????a. PFGE方法的分辨力和可重复性都很高, ??????????b. PFGE方法是肠球菌,？肠杆菌和葡萄球菌基因分型的金标准。 ???????缺点: ??????????a.必须使所有的酶和缓冲液都能浸透凝胶块，准备适宜的DNA样品需 要延长培育时间。近来也有报道葡萄球菌和肠球菌可以用相当短的时间来进行 PFGE分析。 ??????????b.需要昂贵的专业设备。 四、核糖体分型（Ribotyping） 1、原理： ???核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核昔酸序 列。核糖体序列高度保守，针对 大肠杆菌rRNA?制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染色 体核糖体操纵子杂交，细菌的基因 组中通常有多个核糖体基因，分别存在于不同长度的酶切片段中，因此核糖体分 型可以得到类似指纹的结果，因此 是可以分型的。 2