一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法发明专利.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 108103158 A (43)申请公布日 2018.06.01 (21)申请号 201611032168.6 (22)申请日 2016.11.22 (71)申请人 天津华大医学检验所有限公司 地址 300000 天津市自贸区（空港经济区） 环河北路80号空港商务园东区3号楼 201-1室 申请人 深圳华大基因股份有限公司　 广州华大基因医学检验所有限公司 (72)发明人 张乐橦　宋炎　刘磊　刘军　 朱红梅　叶明芝　 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 孙银行　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 (54)发明名称 一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种高特异性的胚系碱基突 变PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且 有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷 酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增， 修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与 胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变 型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型 模板存在的情况下，DNA聚合酶依赖模板而焦磷 酸解修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核 苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR对样 本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有 无纯合突变或杂合突变。本发明的方法能够提高 A 特异性和灵敏度，可针对胚系碱基突变，并可定 8 量检测基因频率，解决了ASA-PCR假阳性导致基 5 1 3 因频率定量不准的问题。 0 1 8 0 1 N C CN 108103158 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：在无3’-5’ 外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰 引物进行PCR扩增，所述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点 野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情 况下，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核 苷酸，引物正常延伸，野生型模板被扩增，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基 因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。 2.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修 饰引物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶 和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。 3.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述模 板DNA是基因组DNA。 4.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述胚 系碱基突变是替换、插入、缺失或拷贝数变异。 5.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方 法用于多种体液样本的基因检测。 6.根据权利要求5所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所