新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用发明专利.pdfVIP

新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用 技术领域 本发明涉及基因工程领域，具体涉及新型冠状病毒Ad26 腺病毒载体疫苗及 其制备方法 与应用。 背景技术 冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、冠 状病毒科 (family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员，基因组 为单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb 之间，是目前已知基因组最大的 RNA 病毒。人冠状病毒目前已知有 六种，分别是二十世纪60 年代发现的人冠状 病毒229E(HCoV-229E)和HCoV-OC43，2003 年 出现的SARS-CoV，2004 年在荷兰 分离的HCoV-NL63，2005 年在中国香港鉴定的HCoV-HKU1 以及2012 年在中东 地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle Eastrespiratory syndrome virus， MERS) 冠状病毒MERS-CoV。冠状病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以 及神 经系统，造成不同程度的病理性损伤，严重者甚至造成死亡。 在SARS-CoV-2 冠状病毒的病毒颗粒结构中，S 蛋白(spike protein,S protein)是 一个十 分重要的靶点。SARS-CoV-2 冠状病毒的S 蛋白存在融合前构象和融合后 构象，其会识别细 胞膜上受体蛋白ACE2(angiotensin converting enzyme 2)，通过 宿主细胞的弗林蛋白酶进行切 割，使蛋白分为S1 和S2，进而介导并促使病毒 包膜与细胞膜发生融合，融合后产生的抗体 多为结合抗体，没有中和作用，使 疫苗免疫原性大打折扣。 相关技术中，采用的新型冠状病毒的刺突蛋白S 基因(序列号NC_045512.2) 作为靶序 列，但该基因在人肾细胞HEK293 表达水平很低，通过其制备得到的 疫苗可能无效或是效价 很低，不足以抵抗病毒的感染。 因此，开发一种有效且高效的新型冠状病毒疫苗对于新型冠状病毒的防治与 控制具有极 为重要的意义。 发明内容 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提 出一种新型 冠状病毒Ad26 腺病毒载体疫苗，该疫苗采用人Ad26 型腺病毒载体， 解决了人体内Ad5 预 存抗体水平高的难题，提高了疫苗免疫效果，扩大了适应 人群。 本发明的第一个方面，提供一种新型冠状病毒Ad26 腺病毒载体，该Ad26 腺 病毒载体负 载有新冠病毒Spikes 优化序列。 真核细胞转录的mRNA 前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组 合)产生不 同的mRNA 剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同 的蛋白质，这对蛋白的 表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序 列(新冠病毒Spikes 蛋白)进行密码 子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变 剪切位点，保证了新冠病毒Spikes 蛋白表达的唯 一性，减少了蛋白后续纯化的 难度。 本发明通过将密码子优化后，S 基因的弗林蛋白酶切位点发生突变(RRAR 突 变为GSAS)， 同时在S 基因的986aa～987aa 的KV 突变为PP，使S 蛋白维持稳 定的融合前构象，大大提升 了疫苗的免疫原性。将突变后的S 基因整合到复制 缺陷型Ad26 载体上，通过腺病毒感染细 胞，呈递新冠病毒抗原，免疫后使机 体产生特异性免疫反应，从而阻断新冠病毒的感染。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述新冠病毒Spikes 优化序列 如SEQ ID NO.1 所示。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Ad26 腺病毒 载体为复制 缺陷型Ad26 腺病毒载体。 在本发明的一些更优选实施方式中，所述复制缺陷型Ad26 腺病毒载体为缺 失E1 和E3 区基因的复制缺陷型Ad26 腺病毒载体 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，外源基因启动子选 自人巨细胞 病毒CMV 启动子、鼠巨细胞病毒CMV 启动子、EF1a 或PGK1 中的 至少一种。 在本发明的一些优选实施方式中，外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV 启动子或、 鼠巨细胞病毒CMV 启动子。 根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Ad26 腺病毒 载体可以调 控SEQ ID NO：1 所示核酸序列的表达。 本发明的第二