一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法发明专利.pdfVIP

一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法 技术领域 本发明涉及生物学检测技术领域，特别是一种高灵敏新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒及使用方法。 背景技术 2019-nCoV 主要传播途径为经呼吸道飞沫传播，以呼吸道分泌物排出体外， 经口液、喷嚏传染，亦可通过接触传播。感染新冠病毒后潜伏期在3-7 天，一般 不超过14 天，临床表现以发热乏力、干咳为主，鼻塞流涕等上呼吸道症状少见， 约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者进展为急性呼吸窘迫综合征、休克、 难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。 冠状病毒为单链 RNA 病毒，属于巢病毒 目(Nidovirales) 冠状病毒科 (Coronaviridae)，正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinac)，根据血清型和基因组特点 冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ4 个属，已知感染人的冠状病毒有6 种，包括α 属的冠状病毒(HCoV-229E 和 HCoV-NL63) 和β 属的冠状病毒(HCoV-HKU1 、 HCoV-OC43、MERS-CoV 和SARS-CoV)，2019-nCoV 为β属的新型冠状病毒。 2019-nCoV 具有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径60-140nm。 病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有 poly(A)尾，基因组全长约 27-32kb，是目前已知RNA 病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒全基因组通常含 有7 个开放阅读框，每相邻两基因之间存在间隔序列，5’端为非编码区帽子结构， 3’端为多聚腺苷酸非编码区；从5’端起约占据全基因组的三分之二的ORF1(包含 ORF1a 和1b)也称为复制酶基因，负责编码16 个以上与病毒复制相关的非结构蛋 白；靠近3’端的4 个开放阅读框，依次编码S 蛋白(spikeprotein)、E 蛋白(envelope protein)、M 蛋白(membrane protein)和N 蛋白(nucleoprotein)。冠状病毒S 蛋白 位于病毒表面形成棒状结构，是用于分型的主要基因。N 蛋白包裹病毒基因组可 用作诊断抗原。 各研究机构及生物公司都致力于相关核酸检测试剂盒的开发和生产，经过半 年多的使用发现，目前市场上的2019-nCoV 核酸检测试剂盒，患者在早期感染阶 段存在漏检情况。“根据天津疾控中心1 月30 日公布的新增确诊案例情况显示， 天津疾控第28 例患者，男，55 岁，与本单位多名新型冠状病毒感染的肺炎患者 为密切接触者。1 月19 日出现发热，1 月25 日就诊于市第四中心医院，两次核 酸检测阴性，予以居家隔离。1 月27 日再次发热，1 月28 日核酸检测阴性，1 月30 日第四次检测为阳性”。上述案例的出现说明一部分早期感染的患者在体液 中病毒载量低，虽然用现有的检测试剂盒多次检测结果为阴性，但是仍然是病毒 感染者且具有感染性。而这类患者的漏检很可能造成周围人群进一步的感染，不 利于病毒传播的控制。申请号为202010160474.8 的中国发明专利，公开了一种 新型冠状病毒N 基因核酸检测试剂盒，采用N 基因特异引物和Taqman 探针，结 合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV N 基 因的检测。申请号为202010160162.7 的中国发明专利，公开了一种新型冠状病 毒ORF1ab 基因核酸检测试剂盒用ORF1ab 基因特异引物和Taqman 探针，结合 特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV ORF1ab 基因的检测。但上述方法分别对不同靶基因进行检测，而且现有方法的检测体系 小，模板加样量小，检测灵敏度不足，因此仍然存在漏检的问题。 发明内容 本发明的目的是要解决现有技术中国存在的问题，提供一种灵敏度高、检出 率高的高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒及使用方法。 为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的： 一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒，包括ORF1ab 基因引 物对、N 基因引物对、内标基因引物对及探针组； 所述ORF1ab 基因引物对包含SEQ ID NO.1-2 所示的ORF1ab 基因上游引物、 ORF1ab 基因下游引物；所述ORF1ab 基因上游引物、ORF1ab 基因下游引物的浓 度分别为0.1-1.5μmol/L； 所述N 基因引物对包含SEQ ID NO.4-5 所示的N