基于理性设计提高枯草芽孢杆菌角蛋白酶的热稳定性.docx

基于理性设计提高枯草芽孢杆菌角蛋白酶的热稳定性 角蛋白是一种结构稳定、不溶于水的蛋白质，主要存在于羽毛、羊毛、毛发、蹄和指甲中虽然角蛋白酶能够有效降解角蛋白废弃物，但是在具体应用场景中的耐受性和稳定性仍然受到挑战目前，蛋白质工程是提高生物催化剂热稳定性的有效手段，主要分为定向进化与理性设计两类蛋白质结构中的柔性环区域loop是提高其稳定性的潜在目标。Loop是一类多样化的二级结构，包括转角、无规则卷曲以及其他连接二级结构的氨基酸链基于同源性分析的方法已经被广泛应用于提高蛋白质的热稳定性。一种相对典型的方法就是将目标蛋白酶的序列或结构与嗜热蛋白酶进行比较，确定突变的关键位点。β-转角是最小的二级结构，由4个残基（位置1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株和质粒 本研究所用大肠杆菌1.1.2 主要实验试剂 PrimeSTAR1.1 3 PCR引物设计 本研究中PCR扩增所用引物通过上海生工生物工程股份有限公司来合成，引物见表1。1.1.4 培养基及培养条件 LB培养基（g/L）：酵母粉 5、蛋白胨 10、氯化钠 10，固体培养基 则加20 g/L的琼脂粉，121℃灭菌15 min。根据实际需要添加相应的抗生素。发酵培养基（g/L）：蔗糖 20、酵母粉 10、蛋白胨 20、Na大肠杆菌、枯草芽孢杆菌培养温度37℃，旋转式摇床220 r/min。1.2 突变体酶的构建利用Quick Change1.3 突变体酶的表达及纯化挑取1.4 角蛋白酶酶活的测定取50 μL适当稀释的酶液，加入150 μL 50 mmol/L的Gly-NaOH溶液（pH 10）作为缓冲液和100 μL浓度为25 g/L的水溶性角蛋白作为底物，混匀后于60℃下反应20 min；加入200 μL 0.5 mol/L的三氯乙酸终止反应，室温12000 r/min离心2 min。取上清200 μL，加入1 mL 50 g/L的Na 酶活单位定义：一个活力单位（U）为吸光度在波长660 nm下每分钟升高0.0011.5 酶的热稳定性研究 半衰期（t半失活温度（1.6 动力学参数研究 将角蛋白底物按照体积分数稀释成不同浓度（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），参照酶活测定方法测定不同底物浓度下的反应初速，计算米氏常数（1.7 分子动力学模拟 角蛋白酶KerZ1与模板greglin以及subtilisin的复合蛋白体KerA（PDB 4gi3, 1.75 ? resolution）的成熟酶氨基酸序列具有99%的同源性，通过在线模拟服务器SWISS MODLE（/interactive），以PDB数据库中KerA的晶体结构为模板，同源模拟角蛋白酶KerZ1及其突变体酶的晶体结构。使用AMBER16进行分子动力学模拟，力场选定ff14SB2 结果与分析2.1 角蛋白酶柔性环区域的改造利用PyMOL软件对KerZ1（PDB 4gi3）中的二级结构进行标注，一共确定了15个Loop环区域。通过将KerZ1的PDB文件提交至在线服务器HotSpot Wizard 3.0（http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard）中计算每个氨基酸残基的B-factor值分子动力学模拟也被用于分析KerZ1结构的灵活性。在300 K下，对KerZ1的结构进行了20 ns的分子动力学模拟，并计算每个氨基酸残基的RMSF值，结果如图2所示。RMSF值反映了构象的灵活度，其值越高，对应的结构柔性越大。结果表明，RMSF值虽然从不同的角度反映构象的灵活度，但是总体的结果与B-factor分析的结果一致，说明两者在预测蛋白质柔性区域方面具有相似性。尽管相关性很强，但是结果中也存在一定差异。例如，根据在300 K下分子动力学模拟计算的RMSF值，KerZ1最灵活的3个环区域是Loop8、Loop9以及Loop5，而B-factor分析下最灵活的3个区域是Loop8、Loop13以及Loop9。因此，结合B-factor分析与分子动力学模拟，最终确定KerZ1的2个柔性环区域作为改造对象，分别是Loop8 127~130和Loop9 152~173。同源性分析最典型的例子是将目标蛋白酶的序列或结构与嗜热蛋白酶进行比对，确定突变的关键位点。YU等基于同源性分析对大肠杆菌转酮酶柔性区域的β-转角进行了改造，提高了热稳定性2.2 角蛋白酶及其突变体酶的表达与纯化 利用Quick Change2.3 角蛋白酶热稳定性测定 将纯化后的KerZ1和A128D置于不同温度下（30℃~80℃）