现代生命科学的发展与人类的生存.pptxVIP

第4节 核酸的研究方法 ;　◇ 　一、核酸的分离、提纯和定量测定 　◇ 　二、核酸的超速离心 　◇　三、核酸的凝胶电泳 　◇ 　四、核酸的核苷酸序列测定 　◇　五、DNA 聚合酶链式反应 　◇　六、DNA 的化学合成;一、核酸的分离、提纯和定量测定;（一）DNA 的分离;用苯酚抽提，除去蛋白质。苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP一起振荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。如此操作反复多次以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐存在的条件下加2倍体积冷的乙醇，可将DNA沉淀出来。用乙醚和乙醇洗沉淀。用此方法可以得到纯的DNA。 用氯仿一辛醇（或异戊醇）与DNP溶液振荡，借助表面变性除去蛋白质，反复多次直至得到不含蛋白质的DNA。此操作过程与苯酚法相似。 ;为了得到大分子DNA，避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入2倍体积含1% （SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K)最后浓度达100ug/mL，在65℃保温4h，蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和蛋白质的部分降解产物。DNA制品中的少量RNA可用纯的RNase分解除去。此方法现在比较常用。 氯化铯密度梯度离心（cesium chloride density gradient centrifugation）也是实验室制