第二章基因工程载体和工具酶.pptxVIP

第二章 基因工程载体和工具酶;本章目录;第二章 基因工程载体和工具酶;载体的功能及特征;克隆载体应具备的条件;1. 质粒 plasmid;天然质粒;;;2. 质粒的不相容性;3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因;Lac Z基因的显色原理：;;;;LacZ基因表达的蓝白斑菌落;基因工程质粒：Plasmid pBR322;Plasmid pBR322结构图;pBR322质粒结构来源;Plasmid plink 322;Plasmid plink 322; pUC 质粒(University of California) ;Plasmid pUC 18/pUC 19 结构 ;改建质粒的要求：;转化子的筛选方法;pBR322 质粒克隆外源基因的过程 ;载体遗传标记检测;载体遗传标记检测;DNA片段大小检测;DNA片段大小检测;质粒DNA提取的策略;质粒DNA的纯化;质粒DNA沉淀;DNA分离;DNA浓度检测;EB与DNA;DNA大小测量;在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？;DNA电泳结果分析;2. λ噬菌体;;λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点;λ-DNA载体的构建：加装选择标记;λ-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ;(一)插入型载体;;在Charon4载体中克隆外源DNA;3. M13单链噬菌体;;大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA;DNA测序片段的扩增;4. 柯斯质粒cosmid;柯斯质粒（cosmid）的结构;柯斯质粒载体的特点：;柯斯质粒的克隆过程;5.人工微小染色体 ;酵母人工染色体（YAC）;YAC的构建;酵母人工染色体的应用;克隆载体的发展历史：;6.穿梭质粒载体 （shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。;大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体;7. 表达载体;; pQE30载体 属于PDS质粒家族 大肠杆菌T5启动子 和转录终止信号 表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头;GEX-4T-1原核表达载体： 具有可高效诱导表达的tac启动子； 采用温和洗脱条件可将融合蛋白从亲和介质中洗脱下来，最大限度减少对蛋白活性的影响； 具有专一性的凝血酶识别位点，可从融合产物中得到纯化的目标蛋白 ;含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒 ;;第二章 基因工程载体和工具酶;用于核酸操作的工具酶;1. 限制性核酸内切酶;限制性核酸内切酶的命名;限制性核酸内切酶的种类;限制性核酸内切酶的分类;II 型限制性核酸内切酶的基本特性;;EcoRI等产生的5‘粘性末端;PstI等产生的3‘粘性末端;PvuII等产生的平头末端;限制性核酸内切酶酶切位点出现频率;同裂酶（同切点酶）： 来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同的序列。 Sau3A I : 5’-GATC-3’ 3’-CTAG-5’ BamH I: 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’;同尾酶： 来源各异，识别靶序列各不相同，但产生相同的粘性末端。 Bgl II : 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ BamH I: 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’;影响限制性核酸内切酶活性的因素;影响限制性核酸内切酶活性的因素;2.缓冲液;;;II 型核酸内切酶的多酶联合酶解;2、DNA连接酶;平头双链DNA片段的连接操作;平头末端人工粘性末端的连接;同种内切酶生产的粘性末端的连接;同尾酶生产的粘性末端的连接;不同粘性末端的连接;DNA连接酶的反应条件：;重组率;转化率;转化率的计算;转化率的影响因素;转化率的影响因素;3.大肠杆菌DNA聚合酶 I;缺口前移标记法;大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;4.反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶;反转录酶的基本特性： 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链;5. 碱性磷酸酯酶;碱性磷酸酯酶;防止载体的粘性末端的自连;T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）;6. 末端转移酶（TdT）;用于人工接头 探针标记;7.单链核酸内切酶：S1核酸酶;;