质粒DNA的提取、纯化和电泳检测.docxVIP

质粒 质粒 DNA的提取、纯化和电泳检测 质粒 DNA的提取、 纯化和电泳检 测 姓名 学号 同组人 班级 实验时间 摘要： 质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的 DNA，它是基因工程中一种 非常重要的载体。质粒 DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最 为广泛的制备质粒 DNA的方法。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳 可用于分离、 鉴定和纯化 DNA片段， 是分子生物学的核心技术之一。 本次实验利用碱变法对 E.coli DH5 受体菌中质粒 pUC19的 DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒 DNA提取的原理、纯化及琼 脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果。 关键词： 质粒 DNA、碱变性提取法、质粒 DNA的纯化、 DNA凝胶电泳 1. 引言 质粒是细菌细胞中与主染色体共存、 可自主 复制的一段大多数呈环形的 DNA。细菌质粒的相 对分子质量大小从 1kb 至 200kb 以上不等。一些 质粒永远独立于染色体之外， 另外一些质粒在一 定条件下会可逆地整合到寄主染色体上， 随着染 色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后 代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载 体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知 的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状 DNA分子 （简称 cccDNA）。 由于质粒分子小、便于分离和提取的特点， 在 DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过 连接外源基因构成重组体， 携带目的基因进入细 菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达， 因此 质粒是基因工程中一种非常重要的载体。 质粒特 征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、 毒力及同源性分析。 近年来由于基因芯片技术的 出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速 的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高 质量的质粒 DNA。因此，质粒 DNA的提取成为分 子生物学实验室一项最基本的工作。 提取和纯化质粒 DNA的方法很多， 目前常用 的有：碱裂解 / 碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石 柱层析法、 EB-氯化铯密度梯度离心法和 Wizard 法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是 一种应用最为广泛的制备质粒 DNA的方法，是基 于染色体 DNA与质粒 DNA的变性与复性的差异而 达到分离目的，适用于不同量质粒 DNA的提取。 该方法操作简单， 易于操作， 一般实验室均可进 行。提取的质粒 DNA纯度高，可直接用于酶切、 序列测定及分析。 碱变性提取质粒 DNA一般包括三个基本步 骤：培养细菌细胞以扩增质粒； 收集和裂解细胞； 分离和纯化质粒 DNA。 在细菌细胞中， 染色体 DNA以双螺旋结构存 在，质粒 DNA以共价闭合环状形式存在。 细胞破 碎后，染色体 DNA和质粒 DNA均被释放出来， 但 是两者变性与复性所依赖的溶 pH值不同。在 pH12.6 的碱性条件下，染色体 DNA的氢键断裂， 双螺旋结构解开而变性； 质粒 DNA的大部分氢键 断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会 完全分离。当用 pH 值 4.8 的 KAc（或 NaAc）高 盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时， 变性的质粒 DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶 解于溶液中； 但染色体 DNA不能复性， 而是与不 稳定的大分子 RNA、蛋白质 -SDS复合物等一起形 成缠连的、 可见的白色絮状沉淀。 这种沉淀通过 离心，与复性的溶于溶液的质粒 DNA分离。溶于 上清液的质粒 DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使 之凝聚而形成沉淀。由于 DNA和 RNA性质类似， 乙醇沉淀 DNA的同时， 也伴随着 RNA沉淀，可利 用 RNaseA将 RNA降解。质粒 DNA溶液中的 RNaseA 移不动同的速度可因不别同各移电动荷，量的大小不异，以及一些可溶性蛋白， 可通过酚 / 氯仿抽提除去， 最后获得纯度较高的质粒 DNA。 反的电电极泳移是动带的电现物象质。在各电种场生中 p中反它H具会的条向电有件分极相下子反移，动的筛可电效的以现应极解移象。离。动含成。有各带种电生荷 中异它带，电。具利其有离用中子分移的的子动电筛大离速效小子度 移不动同的速度可因 不别同各 移电动荷，量的 大小不 异， 同纯的化分D子NA。片因段而，，是凝分胶子电生泳物可学用的于核分心离技、术鉴之定一和。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高， 分辨范围极广。 此外，凝胶中 DNA的位置可以用 低浓度荧光插入染料如 EB 染色直接观察到，甚 至含量少至 20pg 的双链 DNA在紫外激发下也能 直接检测到。 溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染 料，可以插入到 DNA或 RNA分子的碱基之间，