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细胞筛选 一嘌呤霉素 ( 一) 确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时， 需进行滴定， 或制定针对那种 细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。 一般而言， 嘌呤霉素浓度范围在 2-10 微克/ 毫升时是足以 杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。 （筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的 70%~80%时），用新鲜无抗无血 5 清的培养基制成 1.5 ×10 个/ml 的细胞悬液。 4 3. 向 96 孔培养板中加细胞悬液， 每孔 100 微升 （使每孔细胞数在 1.5 ×10 个），然后 向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。 （这样做是为了 保证在固定细胞密度下确定最佳 G418药物筛选浓度。） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为 0,2,4,6,8,10 微克 / 毫升的新鲜无抗无血清培养基 溶液替换各孔中的旧的培养基。 （每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三 次）。（注意： 对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的 反应。） 5. 每日检查细胞活力， 根据细胞活力， 每三天 ( 即每隔两天 ) 更换含嘌呤霉素的新鲜无 抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天） 。 6. 在正常的实验操作规程时， 一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一 般生存时间而定，大概需 3 到 14 天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞 死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。 最优浓度为在 3-5 天内杀死 所有细胞的浓度。 ( 二) 转染细胞 1. 第一天：在 60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度， CO2孵箱过夜培养。 2. 第二天：准备 3ml 无抗生素无血清培养基， 加入 Polybrene 使其终浓度为 8 μg/ml 。 将已经制备的病毒颗粒 0.5ml 加至上述培养基，轻吹混匀。去除 60mm培养皿内的 旧的培养基，加入含病毒培养基。 （Polybrene 能够增加病毒感染的效率，然而， 有时候 Polybrene 对细胞有毒性。这时，可以用 ProtamineSulfate 代替 Polybrene ） ( 三) 筛选细胞 1. 病毒感染后 24 小时，可以换用含最优浓度 puromycin 的培养基。 2. 如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至 4-6 小时，然后换用新鲜培养基， 24-48 小时后换加含最优浓度 puromycin 的培养基。最好设立一个对照皿，不加病 毒液，加入 Ploybrene ，观察 Polybrene 是否对细胞有毒性；如果 Polybrene 没有 毒性，还可以加入 puromycin ，作为 puromycin 是否有效的对照。 3. 以后每隔一天换用新鲜含 puromycin 的无抗生素无血清培养基， 以替换含大量死细