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精品word可编辑 精品word可编辑 精品word可编辑 1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。2、流式同型比照怎样选择？同 型比照〔Isotype Control〕：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消退由于抗体非特异性结合到细胞外表而产生的 背景染色。假设一抗是多抗，可以用an normal serum〔与一抗相同的正常血清〕 〔must be the same species as primary antibody〕。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以询问试剂商。同型比照为免疫荧光标记中的阴性比照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型比照来 调整背景染色。举个例子：比方检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified〔纯化的〕 mouse IgG2a来做OX-42的同型比照〔Isotype Control〕。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。同型比照：是指与 MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，假设使用直接免疫荧光染色法，同型比照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型比照与MoAb所标记的荧光 色素、浓度、F：P比值〔标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值〕应当相同为最正确，这对精确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相 匹配的同型比照，最好为同一试验室、接受相同工艺或方法制备〔犹如一品牌〕的产品。3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：〔1〕 钙荧光探针负载；〔2〕随机测定每管细胞悬液样品〔以下简称样品〕的单个细胞的荧光强度，记为F值。〔3〕参加10%Triton X 100，〔破膜用〕；参加1 mmol/L氯化钙，〔问题所在〕，吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。〔4〕参加EGTA，20μl〔钙螯合剂〕，孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。这个过程中的氯化钙的作用如何， 请高人教导， 感谢。因 为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。加0.1%triton是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作 为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液〔大约1：10000〕，细胞膜对钙的通透性变化对细胞 内钙影响很大。4、流式与werstern的区分，知道一些，缺乏之处请大家补充：〔1〕Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；〔2〕Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50〔很铺张抗体〕；〔3〕接受Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗〔FITC标记的〕的比照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；〔4〕就个人阅历而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。不 过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反响和western、免疫组化没有本质差异，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流 式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是接受western〔尤其是化学发光底物更佳〕和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量〔百分 比〕，假设是高表达的用流式细胞仪格外有优势。5、FL1， FL2， FL3 的区分是什么? 是指在不同位置测得的荧光?还是不同波长的荧光?这3个参数到底测的是什么?有什么意义?你 的理解是正确的，其实FL1， FL2， FL3 是指不同的荧光通道.举个例子来说吧.我们用FITC/PE双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光， 然后这发出的荧光再通过滤光