结晶乳酸脱氢酶的提取.pdfVIP

实验一 乳酸脱氢酶的提取、纯化及活性测定 一、原理 乳酸脱氢酶（ lactate dehydrogenase, 简称 LDH 、EC 、 1、 1、1、27 ）存在于一切有糖酵解作用的细胞 中，最早从牛心肌中分离并获得结晶，后来相继又从兔骨骼肌、鼠肝、猪心及枯草芽胞杆菌等材料中分离 出来。它是可溶性的酶，在 NAD +的存在下，催化乳酸脱氢形成丙酮酸或使丙酮酸还原成乳酸，反应如下： + LDH + 乳酸＋ NAD 丙酮酸 +NADH+H H 2O 丙酮酸 +2,3 －二硝基苯肼 丙酮酸― 2,4 ―二硝基苯腙 ↓ 棕红色的苯腙硝醌化合物 因此，乳酸脱氢酶是肌肉糖酵解过程中的一个重要氧化还原酶。 提取和纯化乳酸脱氢酶的基本方法是用磷酸盐缓冲液抽提，用不同饱和度的硫酸铵分级盐析进行分离 等。为了进行乳酸脱氢酶同功酶的研究，在上述基础上还需进一步纯化。一般采用离子交换或分子筛进行 柱层析。 浓的乳酸脱氢酶溶液在 3～ 15℃下可稳定几个月，但是高度稀释的酶溶液是很不稳定的。一般可将结 晶酶置于 0.5 饱和度硫酸铵溶液中，在低温下保存；或对 0.1M ，Ph7.0 磷酸盐缓冲液透析后冰冻保存，大 约在 2 个月内活性不降低。 从牛心肌中分离出来的乳酸脱氢酶分子量为 135,000±15,000 ，具有 4 个 H 型（ H4）亚基。乳酸脱氢酶 是一个重要的同功酶，有一定的器官特异性，它的变化在一定程度上更加敏感地反映器官的功能状态，因 此在临床诊断上有重要意义。 该酶对一般的抑制剂有较高的稳定性， 但对氯汞苯甲酸可引起酶的完全失活， 而半胱氨酸能使活力恢复。 乳酸脱氢酶具有底物立体专一性，要求 L （+ ）－乳酸作为底物，它与某些来源于细菌的乳酸脱氢酶不 同，那些乳酸脱氢酶可使丙酮酸还原成 D 或 DL －乳酸。 酶活性的测定：采用 2,4-二硝基苯肼比色法测定其总酶活性。以乳酸为底物，经 LDH 催化，脱氢生成 丙酮酸， 与 2,4- 二硝基苯肼反应， 在碱性条件下， 产物呈棕红色， 于 500nm 波长处比色， 测得 LDH 酶活性。 二、试剂与器材 试剂： 1．0.05M ，pH7.4 磷酸盐缓冲液 2．0.08M ，pH7.0 磷酸盐缓冲液 3．0.5M DL- 乳酸钠溶液 4 ．0.002M NAD + 溶液 5．0.1M pH10.0 甘氨酸－氢氧化钠缓冲液 6．底物溶液：甘氨酸－ NaOH 缓冲液 2.7ml ，乳酸钠 0.15ml ，NAD + 0.15ml 混合溶液。 7．2,4 －二硝基苯肼：精确称取 2,4 －二硝基苯肼 19.8mg，溶于 10mol/L 盐酸 10ml 中，溶解后再加蒸 馏水至 100ml。 8．0.4M NaOH 溶液。 9．丙酮酸标准液。 10．DEAE-Sephadex-A50 树脂。 器材： 1．普通离心机 2．低温高速离心机 3．紫外分光光度计 4 ．721 分光光度计 5．层析柱 6．电动搅拌机 三、操作步骤 （一） 配置缓冲液： 1.0.05M ，pH7.4 磷酸盐缓冲液： A 液，配 0.2M,Na 2 HPO4200Ml:71.5 g Na 2HPO4 溶于 1000mL 蒸馏水中； B 液，配 0.2M,NaH PO 100Ml:31.2g Na HPO 溶于 1000mL 蒸馏水中； 2 4 2 4 C 液： 0.2M ，pH7.4 磷酸盐缓冲液： A 液： B 液 =405mL ：95 mL 。4NNaOH 调 pH 到 7.4。