细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响(实验设计).pdfVIP

山东大学实验报告 年 月 日 姓名 程开源 系年级 2010 级临床医学八年制 组别 同组者 科目 分子细胞生物学 题目 细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响 学号 201000232012 【实验目的 】 1．细胞冻存时间对脾脏细胞新陈代谢的影响。 2. 熟悉细胞培养过程中的无菌操作技术。 3．了解细胞原代培养和传代培养的基本方法和主要操作步骤。 4 ．了解体外培养细胞的液氮冻存与复苏技术。 【实验原理】 1. 滋养层细胞的制备 在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或 培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长， 这就是滋养层 细胞。至于滋养层细胞可以促进其它细胞生长的原理目前有两种解释： 一种解释是滋养层细胞 可以减小培养瓶或培养板对细胞的毒害作用； 另一种解释是滋养层细胞可以释放出一些必要的 生长因子， 可以促进目的细胞的生长。 在单抗制备过程中， 刚刚融合的细胞和克隆化的细胞都 比较难以生长，因此都需要添加滋养层才能较快地生长。 在介绍滋养层细胞之前，先来介绍一下制备单抗的培养基体系。 RPMI 1640培养基（ Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 ） RPMI 1640 培养 基（下面简称 1640）最初是 Roswell Park Memorial Institute 用来培养人的淋巴细胞的培 养基，后来被广泛地应用到大部分悬浮细胞的培养中。商品化的 1640 大多以固体形式出售， 也有少数是配好的液体。有的商品化 1640 中不含碳酸氢钠（稳定 pH作用）、不含 HEPES（稳 定 pH作用）、丙酮酸钠（提供碳源）、谷氨酰胺，配制前需要仔细阅读说明书，按照说明书 的要求加入需要额外加入的成份， 尤其是谷氨酰胺， 它是细胞增殖必不可少的成份， 而且谷氨 酰胺特别容易分解，配制完培养基后应该尽快用完，暂时不能用完的放在 4℃或者 - 20℃保存。 大部份商品化的 1640 培养基中都含有酚红作为酸碱指示剂， 1640 的 pH为 7.2-7.4 ，指示剂显 示为红色（如果偏酸则显黄色，偏碱则呈紫色）。 DMEM培养基（ Dulbeccos Modified Eagles Medium ） 是在 Basal Medium Eagle 的基础 上改进的， 最初用于鼠胚胎细胞的培养， 后来广泛地应用于各种贴壁细胞的培养或者发酵罐培 养。与 1640 培养基相比， DMEM培养基营养更为丰富。 DMEM培养基有两种类型， 一种是高糖型， 主要用来培养高密度悬浮细胞，另一种是低糖型，主要用来培养普通的贴壁细胞。与 1640 培 养基一样，商品化的 DMEM培养基使用之间也要按照说明书的要求添加指定的成份。 由于单抗制备 （小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞， 因此上述两种培养基都可以用来 培养杂交瘤细胞。但是这些培养基并不能直接使用，而在使用之前需要加入 15%-20%胎牛血清 （推荐使用 Hyclone 公司、 Gibco 公司或四季青公司胎牛血清），胎牛血清可以为细胞提供更 多的生长因子和激素等活性物质， 添加了胎牛血清的培养基称为完全培养基， 否则称作不完全 培养基。在单抗制备中， 由于需要进行选择性杀死非目标细胞， 所以使用添加 HAT的选择性培 -4