色谱技术亲和色谱.pptxVIP

常见亲合作(hézuò)用体系特异性亲和体系抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）第一页，共69页。第二页，共69页。影响亲和作用(zuòyòng)的因素1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是(dànshì)，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失第三页，共69页。利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术(jìshù)为亲和分离技术(jìshù)亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质第四页，共69页。找与底物专一可逆结合的配基；将配基通过共价键偶联到基质；配基与底物吸附(xīfù)；洗脱目标物。 第五页，共69页。亲和纯化(chún huà)技术亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离）亲和分配(fēnpèi)（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）第六页，共69页。第七页，共69页。配基生物特异性配基拟生物亲和配基亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合(jiéhé)常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性第八页，共69页。专一性和特异性决定(juédìng)着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定(juédìng)着吸附和解吸的难易程度第九页，共69页。亲和配基的分类(fēn lèi)单专一性的小分子(fēnzǐ)配基基团专一性的小分子(fēnzǐ)亲和配基专一性的大分子(fēnzǐ)亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子(fēnzǐ)亲和配基第十页，共69页。亲和配基的选择(xuǎnzé)组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选(shāixuǎn)→优选序列噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选(shāixuǎn)单克隆群体→氨基酸序列SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选(shāixuǎn)第十一页，共69页。亲和洗脱(xǐ tuō)目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度(qiángdù)、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。第十二页，共69页。亲和色谱(sè pǔ)亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类(yī lèi)生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。是亲和分离技术中最具优势的方法第十三页，共69页。平衡液含配体溶液混合蛋白样品带有配体的树脂珠（或胶粒）收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白第十四页，共69页。第十五页，共69页。亲和层析的基本(jīběn)特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对(xiāngduì)较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。第十六页，共69页。亲和色谱(sè pǔ)介质的制备基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附。2．高度的亲水性。3．较好的理化稳定性。4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5．适当的多孔性。　一般(yībān)亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。第十七页，共69页。配基的选择(xuǎnzé) 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻