检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、冠状病毒中和抗体的检测方法发明专利.docxVIP

检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、冠状病毒中和抗体的检测方法 技术领域 本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，冠状病毒疫苗原液在制备检测冠状病毒中和抗体检测试剂中的用途，以及一种冠状病毒中和抗体的检测方法。 背景技术 冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一大类病毒，是直径约80～120nm的RNA病毒。目前已发现有七种可感染人类的冠状病毒，分别是人冠状病毒229E(HCoV-229E)、HCoV-OC43、SARS病毒(SARS-CoV)、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS病毒(MERS-CoV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。 新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒引发的急性呼吸道传染病，在全球各国大规模爆发并急速扩散，目前已成为全球性重大的公共卫生事件，并成为人类历史上致死人数最多的流行病之一。 新型冠状病毒包含四种主要的结构蛋白：刺突(Spike，S)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、包膜(Envelope，E)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白。S蛋白是位于病毒囊膜表面的同源三聚体蛋白，由N端的S1亚基和C端的S2亚基组成。SARS-CoV-2通过位于S1亚基中的受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)识别和结合宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting Enzyme 2，ACE2)，触发细胞膜融合级联反应，从而进入细胞造成感染。 国内外研究人员针对SARS-CoV-2中和抗体进行了大量研究分析。Ju等对从8例SARS-CoV-2感染者的B细胞中分离鉴定出具有病毒中和活性的靶向S-RBD区域的抗体，晶体结构分析显示其通过空间位阻作用抑制病毒与ACE2的结合，从而阻断病毒的进入。Shi等从一名恢复期COVID-19患者中分离出具有强大体外病毒中和活性的单抗，能够抑制恒河猴的SARS-CoV-2感染；结构研究显示其可以识别与S-RBD与ACE2结合位点重叠的表位，通过空间位阻和直接的界面-残基竞争作用干扰病毒/受体的相互作用。Rogers等发现新冠康复者血浆中抗体种类众多，病毒中和活性较高的抗体主要靶向S-RBD上的不同表位，针对其他非RBD表位的单克隆抗体则中和活性相对较低。Brouwer等对筛选到的19株具有假病毒中和活性的抗体进行分析，其中大部分(74％)靶向S-RBD，并结合RBD上不同表位。Piccoli等研究表明，S-RBD区域为免疫显性表位，SARS-CoV-2免疫血清中大约90％已知的中和抗体靶向S-RBD区域。越来越多的研究证据均显示，SARS-CoV-2中和抗体主要识别表位为S-RBD区域，通过抑制病毒RBD与宿主细胞受体ACE2的结合发挥保护作用。此外，针对中和抗体的体外病毒中和数据和在实验动物模型体内的活病毒挑战数据，均显示中和抗体对SARS-CoV-2具有保护作用的潜力。 已批准使用的疫苗III期临床试验中，尽管接种疫苗的受试者有一定的感染率，但相对于安慰剂组，已经证明了疫苗对疾病的保护力。疫苗临床及相关研究数据显示，中和抗体在防止(或减轻)新冠感染中起着重要的作用，因此对于中和抗体的检测也至关重要。中和抗体检测的实验室“金标准”是感染抑制试验，主要包括蚀斑减少中和试验(plaquereduction neutralization test，PRNT)和微量中和试验(Micro-neutralization assay，MNA)。对于新冠中和抗体的检测，两种方法均将定量SARS-CoV-2病毒与不同稀释度的待测样本混合后，接种到单层Vero细胞上。通过细胞的病毒变程度，建立抑制曲线，评估样本中中和抗体的滴度。两种方法中均涉及SARS-CoV-2活病毒，对试验环境的生物安全等级要求高。 发明内容 本发明目的在于提供一种试剂盒，以及一种冠状病毒中和抗体的检测方法，旨在解决现有中和抗体检测技术中存在的对生物安全级别要求高、操作复杂、检测通量低的技术问题。 为了实现上述发明目的，本发明一方面，提供了一种检测冠状病毒中和抗体的试剂盒，其包括冠状病毒疫苗原液和活性物质，所述活性物质包括血管紧张素转化酶2(ACE2)蛋白或其片段、酪氨酸蛋白激酶受体(AXL)蛋白或其片段、结合抗体中的至少一种，所述结合抗体能与所述冠状病毒疫苗原液结合，所述结合抗体包括冠状病毒中和抗体和其它抗体。 本发明提供的试剂盒，利用ACE2可以被SARS-CoV-2的RBD识别和结合从而进入细胞造成感染、AXL可以促进SARS-CoV-2病毒附着进入细胞并增强感染、结合抗体能与冠状病毒疫苗原液结合的特点，通过以冠状病毒疫苗原