化学发光分析.pptVIP

第三十一页，共70页 仪器光路图 第三十二页，共70页 仪器框图 该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析； 第三十三页，共70页 同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(??)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的??可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； ??60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定 第三十四页，共70页 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 第三十五页，共70页 磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量（采用低温磷光分析法，即试样溶液需要低温冷冻）。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶(盛有液氮 )。 第三十六页，共70页 五、荧光分析方法与应用 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级 检测下限：0.1～0.001 μg·mL－1 其一，荧光强度正比于入射光的强度，所以增大光源的强度可以提高灵敏度，降低检测限；其二，荧光的测量是在激发光的垂直方向检测的，即在暗背景中检测，所以只要较好地消除杂散光，采用较灵敏的检测器，很微弱的荧光都可以检测，所以检测限较低。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 第三十七页，共70页 用检测限来表示荧光法的灵敏度，在实际工作中是比较直观和方便的。荧光分析法的检测限可以有两种表示方法： 一是以喹宁表示，在0.05mol·L－1硫酸中，喹宁的荧光峰为450nm，当喹宁溶液很稀（如0.05μg·L－1）时，溶剂的拉曼峰所造成的对喹宁荧光信号的噪声已相当显著。因此人们常以此时喹宁信号与仪器噪声之比的喹宁浓度定为该仪器的检测灵敏度。多数仪器的检测灵敏度为0.05μg·L－1喹宁，有些灵敏度高的仪器可达0.005μg·L－1喹宁； 二是以水的拉曼光信噪比表示，当水分子被激发时，水分子蒙受暂时的畸变，在极短的时间内（10－12－10－15s），会向各个方向发射出与激发光波长相等的瑞利光和波长略长的拉曼光。通过测量拉曼光的信噪比可以衡量仪器的检测灵敏度。由于纯的水易得，用同一波长的光激发水分子所产生的拉曼光波长一样，便于检测，所以用拉曼光信噪比表示仪器的灵敏度已为较多的产家所采用。 第三十八页，共70页 ★ 常规分析应用： ☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略） ★ 高端生化研究： ☆ 分子相互作用研究； ☆代谢动力学跟踪； ☆ 显微成像（物理迁移与化学衍化的原位“显迹”） 第三十九页，共70页 2.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If = ? Ia 由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10-? l c ) If = ? I0(1-10-? l c ) = ? I0(1-e-2.3? l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 ? I0 ? l c = Kc 第四十页，共70页 （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； 第四十一页，共70页 3.荧光分析法的应用 (1)无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)生物与有机化合物的分析 第四十二页，共70页 第四十三页，共70页