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在 293 细胞中大量扩增腺病毒 一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在 293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺 病毒感染周期的基本方法， 按这一方法最终得到的病毒量约为 3 ×1011 ～3 ×1012 。由于一个细胞中 所含的病毒颗粒为 1000 ～ 10000 ，因此 1L 培养细胞可得到约 5 ×1012 病毒颗粒。如果要把病毒用 氯化铯梯度离心纯化，则必须至少 3 ×108 的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则 根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提 (根据蛋 白类型的不同抽提上清或细胞沉淀 ) 。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同 步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意 每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都 用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。 操作步骤： 1 在 100 培养皿或 752 培养瓶中加入 10 5% 培养 5 ×106293 细胞。 2 取 0.5 首次扩增的病毒保存液，加入 5% 至 1 ，混匀，这样稀释得到的 值约为 5 。 3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动 3 次， 37 ℃ 2 孵箱中培 养 90 分钟。 4 加入 9 5% 。 5 再培养 72 小时，这时在 10 溶液中大约有 5 ×109 ～5 ×1010 个病毒颗粒， 进行 测定以估计病毒 颗粒。 注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞， 600 ×g 离心 5 分钟沉 淀细胞，去上清后加入最小体积 (一般为原始体积的 1/10 即 1)病毒保存溶液重悬细胞。 -200C /370C 冻融 3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。 1 -20 ℃/37 ℃冻融 3 次。 2 转入 15 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心 10 分钟，收集上清冻存于 -20 ℃或 -80 ℃。 3 3 个 1752 培养瓶中各加入 107 293 细胞进行培养。 4 将 3 细胞裂解液上清加入 12 5% 中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入 5 混合液，十字形慢 慢晃动混匀 3 次， 370C 52 孵箱中培养 90 分钟。此时 值约为 25 。 5 加入 5% 至 30 。 6 再培养 48 ～72 小时。此时 10 培养液病毒量约为 3 ×1010 ～3 ×1011 。若需要，进行 测定以估 计病毒滴度。 注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。 600 ×g 离心 5 分钟收集 细胞，弃上清，加入 1/10 原始体积的溶液重悬细胞。 -200C /370C 冻融 3 次，台式离心机上以最 大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。 12. 移入 50 离心管中，台式离心机上最大速率离心 10 分钟，取出上清保存。 13. 30 瓶 175 2 培养瓶中每瓶各加入 107 293 细胞。 14. 将 45 细胞裂解液上清加入 105 5% 混匀，从培养瓶中移去培养液，加入 5 混合液感染细胞，十 字形缓慢晃动 3 次混匀， 370C 培养 90 分钟。此时 值约为 25 。 15. 加入 5% 至 30 瓶。 16. 再培养 48-72 小时，此时约有 3 ×1011 ～3 ×1012 个病毒。若需要，进行 测定估计病毒滴度。 如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在 5 5% 中。-200C /370C 冻融 3 次，离心沉 淀细胞碎片。此时