蛋白质电泳技术介绍PPT参考课件.pptVIP

5. 固定 取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。 * Company Logo 6. 测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。 * Company Logo 优缺点 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离和鉴定 。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。 * Company Logo 双向电泳 （2-D electrophoresis） * Company Logo 基本原理 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离（将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。 * 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS水平方向：反映出蛋白在pI上的差异 垂直方向：反映出它们在分子量上的差别 图解 * Company Logo 2D电泳操作流程 细胞裂解匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量 样品制备 挖点 酶解 点靶 蛋白鉴定 分离 双向电泳 第一向 第二向 染色 银染 考染 荧光 图谱分析 图像获取 图谱分析 * Company Logo 1.样品制备 2.固相预制胶条的水化 3.第一向等电聚焦 3.1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温平衡。 3.2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品。 3.3. 去除预制IPG胶条上的保护层 。 具体步骤 * Company Logo 3.4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中 。 3.5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。 3.6. 对好正、负极，盖上盖子。 3.7. 设置等电聚焦程序。 4.胶条的平衡 4.1冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 * Company Logo 4.2配制胶条平衡缓冲液 I 。 4.3吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 4.4第一次平衡。振荡15分钟。 4.5配制胶条平衡缓冲液 II 。 4.6第二次平衡 ，振荡15分钟。 4.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。 * Company Logo 4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。 5.第二向SDS电泳 6.凝胶的染色及检测 7.PDQuest软件分析 8.质谱鉴定 * Company Logo LOGO Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo 电泳技术介绍 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE) * Company Logo 基本原理 1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 2.蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理，可解聚成亚基,加入SDS，改变了蛋白质的构象。 3.各种SDS-蛋白质复合物均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原蛋白质，消除了不同蛋白质的荷电差异。 * Company Logo 图解 * Company Logo 多孔凝胶 混合大分子 电泳 * Company Logo 操作流程 制胶 上样 电泳 染色 脱色 * Company Logo 制胶 1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好 2 按照配方制备分离胶，TEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶 3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面） 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5m